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Estudo da expressão do gene da Caderina-E por RT-PCR.

 

A caderina-E é uma molécula de adesão cálcio-dependente do grupo das Caderinas [1]. Durante a embriogénese a caderina-E é essencial nos processos de diferenciação e morfogénese tecidular. Pós-embriogénese estas moléculas desempenham um papel fundamental na adesão celular entre células epiteliais (Fig. 1).

Dada a importância da caderina-E na adesão celular e manutenção da arquitectura tecidular, foi postulado que a perda da sua função poderia desempenhar um papel fundamental na perda de adesão entre células tumorais e consequente invasão local e metastização tumorais.

De facto, foram encontradas alterações estruturais e funcionais do gene/proteína da caderina-E associadas ao desenvolvimento e progressão de vários tipos de tumores, principalmente carcinomas difusos do estômago e carcinomas lobulares da mama. Uma das alterações descritas com mais frequência é a presença de transcritos aberrantes da caderina-E em carcinomas do estômago [2].

O objectivo deste trabalho é estudar a expressão da caderina-E em diversas linhas celulares de carcinoma do estômago. A técnica de RT-PCR permite avaliar simultaneamente a expressão de mRNA da caderina-E e a integridade dos respectivos transcritos.

 

Fig. 1- As caderinas fazem parte de um vasto grupo de moléculas envolvidas na adesão inter-celular. A caderina-E participa na adesão entre células epiteliais e localiza-se preferencialmente em estruturas de adesão denominadas zonula adherens (adhesion belt).


Neste trabalho serão utilizados dois pares de primers:

ECAD3-6

5'-AGTCACGCTGAATACAGTGG-3'

5'-ATGACACAGCGTGAGAGAAG-3'

 

ECAD7-10

5’-ATCAGTGTGGTCACCACTGG-3’

5’-ATGTACTGCTGCTTGGCCTC-3’

 

O gene da caderina-E é constituído por 16 exões (Fig. 2). Os produtos de amplificação destes primers têm um tamanho de 372 bp e 377 bp, respectivamente. Os primers ECAD3-6 amplificam o cDNA da caderina-E entre os exões 3 e 6 e os primers ECAD7-10 entre os exões 7 e 10.

 

Fig. 2 – A caderina-E é uma molécula de membrana com um porção extra-celular (EC), uma porção trans-membranar (TM) e uma porção intra-citoplasmática (CP). Os elementos SIG e PRE são peptídeos de sinalização que não fazem parte da proteína madura. A extremidade N-terminal da proteína é responsável pela interacção com outras moléculas de caderina-E de células vizinhas e a extremidade C-terminal é responsável pela ligação da caderina-E a proteínas citoplasmáticas (ex. Cateninas).

 

O presente trabalho implica a elaboração de um relatório científico que deverá obedecer ao formato clássico deste tipo de textos: título e identificação do autor; introdução (disponibilizando a informação mínima necessária para compreender a pergunta que vai ser feita); material e métodos (listagem de material e explicação sucinta da metodologia); resultados (descrição factual dos resultados, sempre que possível com recurso a imagens, esquemas e tabelas); discussão (interpretação dos resultados, estabelecimento de hipóteses explicativas e conclusões); bibliografia (usar o formato da bibliografia deste texto - última página).

Como sugestão para a discussão do relatório fornecem-se as seguintes palavras-chave: caderina-E; mRNA; mutação; splicing; carcinoma difuso do estômago.


MATERIAL

Equipamento

Reagentes

Máquina de PCR

Água esterilizada

Sistema de electroforese em agarose

Tampão Transcriptase Reversa 5x

Pipetas (10, 20, 100 e 1000 ml)

Primer pd(N)6 (50 mM)

Eppendorfs de 1,5 ml e 0,5 ml para PCR

Inibidor de RNases (40 u/ml)

Gelo ou placa fria

Transcriptase Reversa (20 u/ml)

Trans-iluminador de UV's

Tampão Taq polimerase 10x

Luvas de laboratório

dNTP's (20 mM)

 

Primers Forward e Reverse (20 mM)

 

Taq polimerase (5u/ml)

 

Agarose

 

6x Azul de bromofenol

 

20xTBE (Tris-Borato-EDTA)

 

Brometo de etídio (10mg/ml)

 

Marcador de peso molecular para DNA

 

Amostras

RNA de linhas celulares de carcinoma do estômago

KATOIII           MKN45           L195               GP220

 


Protocolo

ATENÇÃO:

O RNA é extremamente degradável. Manter as amostras sempre em gelo e congelar imediatamente após a sua utilização.

A técnica de PCR é extremamente sensível a contaminações com DNA. Todo o material e reagentes tem que estar livres de DNA contaminante. De igual modo é necessário o máximo cuidado para evitar contaminações entre amostras; sempre que existam dúvidas quanto ao material (especialmente tubos e pontas de pipeta) é preferível substitui-los. Para controlar este problema todas as experiências têm que ser acompanhadas de um controlo negativo ou branco.

Embora a temperatura óptima de actividade da Taq polimerase seja 720C, esta enzima começa a apresentar actividade a partir de @ 200C. Para evitar a actividade precoce da enzima é necessário manter os componentes da reacção em gelo a @ 40C antes de se iniciar a reacção de PCR.

As radiações UV provocam queimaduras. Cuidado a manusear o trans-iluminador de UV’s.

 

I- Síntese de cDNA

Cada grupo trabalhará com uma linha celular ou branco.

1- Num tubo de PCR preparar a seguinte reacção (volume total = 20 ml):

                        Água                           10,9 ml

                        5x Tampão RT           4 ml

                        DTT                            0,2 ml

                        dNTP’s                       0,4 ml

                        Primer                        1 ml

                        Inibidor RNases        0,5 ml

                        RT                               1 ml

                        Amostra RNA            2 ml

2- Manter os tubos à temperatura ambiente e programar o aparelho de PCR para o seguinte programa:

                        - 370C             60’

                        - 940C             5’

                        - 40C               ¥

3- Colocar os tubos no aparelho e iniciar a reacção.

 

II- PCR

Cada grupo efectuará dois PCR’s (ECAD3-6 e ECAD 7-10) para a linha celular/branco respectiva(o).

1- Num tubo de PCR, e para cada um dos PCR’s, preparar a seguinte reacção (volume total = 25 ml):

                        Água                           18,4 ml

                        10x Tampão Taq       2,5 ml

                        dNTP’s                       1 ml

                        Primer F                     1 ml

                        Primer R                     1 ml

                        Taq polimerase         0,1 ml

                        Amostra cDNA          1 ml

 2- Mantendo os tubos em gelo, programar o aparelho de PCR para o seguinte programa:

            - 940C             4’

                                     - 940C             30’

           35 ciclos          - 600C             30’’

                                     - 720C             30’’

           - 720C             6’

           - 250C             ¥

3- Rapidamente colocar os tubos no aparelho e iniciar a reacção.

 

II- Gel de agarose

1- Montar o suporte do gel e respectivos pentes.

2- Num matraz pesar 4 g de agarose e completar o volume até 200 ml com 1xTBE.

3- Ferver esta solução até à completa dissolução da agarose.

4- Baixar a temperatura até @ 500C.

5- Adicionar 5 ml de Brometo de etídio ao gel e misturar bem.

6- Verter o gel no suporte respectivo e deixar solidificar durante 20 mins.

 

III- Electroforese

1- Com cuidado retirar o(s) pente(s) do gel.

2- A cada amostra adicionar 5 ml de 6x Azul de Bromofenol.

3- No 1º poço de cada linha do gel colocar 10 ml de marcador de peso molecular para DNA. Nos restantes poços colocar 25 ml das diferentes amostras.

4- Correr as amostras a 120 V até que o azul de bromofenol tenha migrado cerca de 2/3 do gel.

5- Visualizar o gel no trans-iluminador de UV’s e anotar os resultados obtidos.

 

Bibliografia

1- Takeichi M. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Science 251:1451-1455, 1991.

2- Becker KF, Atkinson MJ, Reich U, et al. E-cadherin gene mutations provide clues to diffuse type gastric carcinomas. Cancer Res 54:3845-3852, 1994.

 

Resultados

 

Últimas modificações: 19-06-2003

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