Επιστροφή στην αρχική σελίδα
Επιστροφή στις δημοσιεύεσεις

συνεχιζόμενη ιατρική εκπαίδευση

 Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής 1993, 10:313-320

 Καλλιέργειες δερματικών μοσχευμάτων

Θ. Κ. Κόνωνας

Τμήμα Πλαστικής Χειρουργικής - Χειρουργικός Τομέας, Ιπποκράτειο Πε­ριφερειακό Νοσοκομείο Αθηνών, Αθήνα

1. Εισαγωγή

2. Εξέλιξη της μεθόδου καλλιέργειας κερατινοκυττάρων

2.1. Περιγραφή μεθόδου

3. Κλινικές εφαρμογές

3.1. Καλλιέργειες αλλογενών κυττάρων

3.2. Πλεονεκτήματα - Μειονεκτήματα

4. Σύνθετα μοσχεύματα χορίου και καλλιεργηθέντων κερατινοκυττάρων

5. Αποτελέσματα

6. Συμπεράσματα

1. Εισαγωγή

Το δέρμα αποτελεί το μεγαλύ­τερο όργανο του ανθρώπινου σώ­ματος και η απώλεια της ακεραιό­τητάς του δεν είναι άνευ συνε­πειών για τον οργανισμό.Η πρωταρχική λειτουργία του δέρματος είναι ότι αποτελεί διαχω­ριστικό φραγμό του οργανισμού με το εξωτερικό περιβάλλον. Η διάσπαση αυτού του φραγμού οδη­γεί σε διαταραχές του ύδατος και των ηλεκτρολυτών, είσοδο μικρο­βίων και μόλυνση, μεταβολικές διαταραχές, ανοσοκαταστολή και πόνο'. Το συνηθέστερο αίτιο σημα­ντικής απώλειας δέρματος είναι το έγκαυμα. Άλλα αίτια είναι οι χρό­νιες εξελκώσεις συνεπεία φλεβι­κής στάσης, τα έλκη διαβητικής αι­τιολογίας, οι χειρουργικές εκτομές γιγάντιων μελαγχρωματικών σπί­λων, η νόσος του Buerger, το γαγγραινώδες πυόδερμα, η πομφολυ­γώδης επιδερμόλυση καθώς και οι απώλειες δέρματος τραυματικής αιτιολογίας.

Η μεγαλύτερη επίτευξη στον τομέα των εγκαυμάτων ήταν η ευ­ρεία εφαρμογή κατά τον 2⁰ Παγκό­σμιο Πόλεμο των δερματικών αυ­τομοσχευμάτων μερικού πάχους για την επικάλυψη των εγκαυματι­κών επιφανειών.² Σήμερα, με τη φαρμακευτική και τεχνολογική υ­ποστήριξη του εγκαυματία σε ε­γκαυματικές μονάδες, αυξήθηκε ο αριθμός των εγκαυματιών που επι­βιώνουν με λίαν εκτεταμένα ε­γκαύματα. Έτσι, το πρόβλημα των περιορισμένων δοτριών περιοχών καθίσταται οξύ αφού η επιβίωση εί­ναι άμεσα συνυφασμένη με την ε­πικάλυψη των εγκαυματικών επι­φανειών με δερματικά αυτομο­σχεύματα..³ Σημαντικό βήμα για την επικάλυψη των εγκαυμάτων και την αντιμετώπιση του προβλή­ματος των περιορισμένων δοτριών περιοχών, αποτέλεσε η ανακάλυ­ψη των δικτυωτών δερματικών αυ­τομοσχευμάτων.⁴ Αυτά, εκτός του ότι μπορούν να διαταθούν και να καλύψουν πολλαπλάσια επιφάνεια από αυτή της αρχικής τους, δη­μιουργούν επίσης τις συνθήκες που είναι απαραίτητες για την κα­λύτερη πρόσληψη των μοσχευμά­των επιτρέποντας την έξοδο διάμέσου των διακένων τους, αίματος, πύου και εξιδρώματος.⁵

Η πρόγνωση των εγκαυματιών με εκτεταμένα εγκαύματα, ε­ξαρτάται από την όσον το δυνατόν ταχύτερη επικάλυψη των εγκαυμά­των με δερματικά αυτομοσχεύματα. Εκτεταμένα ολικού πάχους ε­γκαύματα εφόσον δεν καλυφθούν με δερματικά μοσχεύματα, θα έ­χουν ως συνέπεια τον θάνατο του εγκαυματία από σήψη ή έκπτωση της λειτουργίας πολλών συστημάτων. Μέχρις ότου επικαλυφθούν οι εγκαυματικές επιφάνειες με δερ­ματικά αυτομοσχεύματα, αυτές μπορεί να καλυφθούν προσωρινά με χοίρεια ξενομοσχεύματα, αν­θρώπινα ομοιομοσχεύματα, ή διάφορες συνθετικές μεμβράνες.^6-8Με την προσωρινή επικάλυψη των εγκαυμάτων, μειώνονται οι απώ­λειες θερμότητας, η πιθανότητα μόλυνσης του τραύματος, ανακου­φίζεται ο εγκαυματίας από τον πό­νο και τέλος δίνεται ο χρόνος να σχηματισθεί υγιής κοκκιώδης ι­στός πάνω στον οποίο θα ευδοκι­μήσει πιο εύκολα το δερματικό αυτομόσχευμα.

2. Εξέλιξη της μεθόδου καλλιέργειας κερατινοκυττάρων

Επειδή ο ανθρώπινος οργανι­σμός δεν μπορεί για ανοσοβιολο­γικούς λόγους να ανεχθεί άλλους ασύμβατους ιστούς, το αυτόλογο δέρμα εξακολουθεί να παραμένει ο μοναδικός τρόπος επικάλυψης των εγκαυμάτων.² Οι ερευνητές σε μια προσπάθεια επίλυσης του προ­βλήματος των περιορισμένων δο­τριών περιοχών σε εκτεταμένα ε­γκαύματα, καλλιέργησαν κύτταρα επιδερμίδας  in vitro,^9-14που αφού πολλαπλασιάζονταν θα τοποθε­τούνταν εκ νέου με τη μορφή αλ­λογενών ή αυτογενών μοσχευμά­των για αποκατάσταση του απολε­σθέντος δέρματος. Ο αρχικός εν­θουσιασμός ήταν τόσο μεγάλος, ώ­στε το 1948 ερευνητής διακήρυττε ότι θα μπορούσαν να παραχθούν σχεδόν απεριόριστες ποσότη­τες καλλιεργηθέντος δέρματος, αρκεί μόνο να υπήρχαν αρκετά μεγά­λα δοχεία για την αποθήκευσήτους.¹⁵ Αν και τα πρώτα αποτελέ­σματα ήταν αποθαρρυντικά, πειρα­ματικές εργασίες από τον Karasek το 1968¹⁰ και στη συνέχεια από τους Freeman και Ige1,¹⁶ απέδει­ξαν ότι κερατινοκύτταρα που ανα­πτύσσονται σε καλλιέργειες είναι δυνατόν να μεταμοσχευθούν και να εξακολουθήσουν να πολλαπλα­σιάζονται in vivo.

Οι Rheinwald και Green το 1975,¹⁷ πρώτοι περιέγραψαν τη μέ­θοδο καλλιέργειας κερατινοκυττά­ρων. Η επιτυχία τους στηρίχθηκε στην προσθήκη στο θρεπτικό υλι­κό ενός παράγοντα που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττά­ρων της επιδερμίδος (EGF) καθώς και στη χρησιμοποίηση ενός υπο­στηρικτικού υποστρώματος από νεκρωθέντα με ακτινοβολία κύττα­ρα, τα καλούμενα 3Τ3 κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά, που είναι ινοβλά­στες που λαμβάνονται από τρωκτι­κά (ποντικό), αποτελούν είδος ι­κριώματος πάνω στο οποίο πολλα­πλασιάζονται τα κερατινοκύτταρα. Όσον αφορά τον Επιδερμικό Αυξη­τικό Παράγοντα (EGF), αυτός απο­τελεί ένα πολυπεπτίδιο που αυξά­νει τις μιτώσεις. Ευθύνεται επίσης για την παράταση της ζωής των κυττάρων καθώς και για την ικανό­τητα να διεγείρει την έναρξη παραγωγής νέων αποικιών κυττάρων.¹⁸ Το 1979, καλλιέργειες κερατινο­κυττάρων που είχαν παραχθεί in vitro από τους Green και Kehinde¹⁹ ήταν δυνατό να χρησιμοποιηθούν για μεταμόσχευση.

Οι Eisenger και συν. το 1980^2Ο ανέπτυξαν δική τους τεχνική καλ­λιέργειας κερατινοκυττάρων χω­ρίς να χρησιμοποιήσουν 3Τ3 κύτ­ταρα ή ιδιαίτερα θρεπτικά υλικά. Έτσι μπόρεσαν να καλύψουν τραύ­ματα σε χοίρους και σκύλους που το δέρμα τους μοιάζει με αυτό του ανθρώπου. Όπως οι ίδιοι αναφέ­ρουν, οι εργασίες τους στηρίχθη­καν σε προγενέστερες πειραματι­κές εργασίες που χρονολογού­νταν από το 1952 και παλαιότε­ρα.^21,22

Με τις σημαντικές αυτές πει­ραματικές εργασίες, άνοιξαν νέοι ορίζοντες για την επικάλυψη των δερματικών ελλειμμάτων με καλ­λιέργειες κερατινοκυττάρων, που άρχισαν να εφαρμόζονται κλινικά στις αρχές της δεκαετίας του 1980.

2.1. Περιγραφή μεθόδου

Σημαντικό ήταν να δημιουρ­γηθεί μια τεχνική που θα ήταν εύ­κολο να αναπαραχθεί και που θα έ­δινε σταθερά αποτελέσματα. Οι καλλιέργειες των κερατινοκυττά­ρων στα περισσότερα κέντρα^23-25 γίνονται σύμφωνα με τις αρχές ό­πως έχουν αρχικά καθορισθεί από τους Rheinwald και Green¹⁷με μι­κρές μόνο τροποποιήσεις. Με αυ­τή τη μέθοδο, είναι δυνατόν κερα­τινοκύτταρα που λαμβάνονται από βιοψία δέρματος, να πολλαπλασιά­ζονται από 1000 μέχρι 10000 φο­ρές με αποτέλεσμα να λαμβά­νονται νησίδες κερατινοκυττάρων τόσες ώστε να επαρκούν για την κάλυψη ακόμη και ολόκληρης της επιφάνειας του ανθρώπινου σώ­ματος.

Η μέθοδος καλλιέργειας των κερατινοκυττάρων έχει ως εξής: Α­μέσως μετά την εισαγωγή του ε­γκαυματία στην εγκαυματική μονά­δα, λαμβάνεται από την περιοχή της μασχάλης με τοπική αναισθη­σία βιοψία δέρματος ολικού πά­χους επιφάνειας 2 τ.εκ. Βιοψίες δέρματος μπορούν επίσης να λη­φθούν από τα πέλματα, τις παλά­μες ή το δέρμα της πόσθης. Το δέρμα στη συνέχεια τοποθετείται σε θρεπτικό υλικό και μεταφέρεται στο εργαστήριο για να αρχίσει η διαδικασία της καλλιέργειας. Στο εργαστήριο και κάτω από αυστηρά άσηπτες συνθήκες, απομακρύνε­ται από το δέρμα το υποδόριο λί­πος καθώς και αρκετό από το χό­ριο. Το δέρμα στη συνέχεια κατα­τεμαχίζεται σε όσον το δυνατόν μι­κρότερα κομμάτια. Αφού αυτά επε­ξεργασθούν κατάλληλα με θρυψί­νη, διαχωρίζονται τα επιδερμικά κύτταρα από το χόριο με αποτέλε­σμα να λαμβάνεται μετά από φυγο­κέντρηση εναιώρημα κυττάρων. Τα διαχωρισθέντα με τη βοήθεια της θρυψίνης κύτταρα, εμβολιάζονται σε διάφορες πυκνότητες σε τρι­βλία που περιέχουν νεκρωθέντα με ακτινοβολία 3Τ3 κύτταρα. Οι καλλιέργειες τρέφονται με ενισχυ­μένο υλικό Eagle εμπλουτισμένο με 20% εμβρυϊκό βόειο ορό, υδρο­κορτιζόνη και χολαρογόνο, αντιγόνο­ της χολέρας που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια επω­άζονται σε 37 βαθμούς C^o και σε α­τμόσφαιρα που περιέχει 10% CO². Μετά από 3 ημέρες προστίθεται Ε­πιδερμικός Αυξητικός Παράγων(EGF).¹⁸ Το θρεπτικό υλικό αλλάζε­ται κάθε 3-4 ημέρες, ενώ προοδευ­τικά αρχίζουν να δημιουργούνται πολλές μονόστοιβες καλλιέργειες. Οι καλλιέργειες καθώς συρρέουν, συνενούνται μεταξύ τους για να σχηματίσουν τελικά ένα διαφορο­ποιημένο, πολύστοιβο στρώμα κυττάρων.²⁶ Μετά  2-3 εβδομά­δες, οι νησίδες αυτές των επιδερ­μικών κυττάρων είναι έτοιμες να χρησιμοποιηθούν για επικάλυψη των εγκαυμάτων ή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να δημιουργηθούν δευτερογενείς ή και τριτο­γενείς καλλιέργειες. Τα συρρέο­ντα κερατινοκύτταρα αποσπώνται από τα τριβλία όπου έχουν καλ­λιεργηθεί με τη βοήθεια του ενζύ­μου Dispase.¹¹ Στη συνέχεια ξε­πλένονται με θρεπτικό υλικό που δεν περιέχει ορό για να απομα­κρυνθούν έτσι από τα κερατινοκύτ­ταρα οι ξένες προς αυτά πρωτεΐνες, δηλαδή ο βόειος εμβρυϊκός ο­ρός, ο Επιδερμικός Αυξητικός Πα­ράγων και το χολαρογόνο. Τα έτοι­μα προς μεταμόσχευση κερατινο­κύτταρα τοποθετούνται σε διπλές βαζελινούχες γάζες με την πλευ­ρά που αντιστοιχεί στη βασική μεμβράνη να βλέπει προς τα πάνω. Στην εκτεθειμένη προς τα πάνω πλευρά των μοσχευμάτων, τοποθε­τείται εκ νέου άφθονο θρεπτικό υ­λικό χωρίς ορό. Πολλά τριβλία που περιέχουν μοσχεύματα, τοποθε­τούνται σε ένα μεγάλο σφραγισμέ­νο δοχείο, έτοιμα να μεταφερθούν στο Χειρουργείο προς χρησιμο­ποίηση
.

3. Κλινικές εφαρμογές

Το 1981 ο Ο' Connor και οι συ­νάδελφοί του²⁷ ανακοίνωσαν για πρώτη φορά την εφαρμογή καλ­λιεργηθέντων δερματικών αυτομο­σχευμάτων σε δυο ενήλικες ηλι­κίας 38 και 61 ετών με εγκαύματα 80% και 40% αντίστοιχα. Οι καλ­λιέργειες τοποθετήθηκαν σε μερι­κές μόνο από τις εγκαυματικές ε­πιφάνειες, ενώ οι υπόλοιπες καλύ­φθηκαν με δικτυωτά δερματικά αυ­τομοσχεύματα. Την καλύτερη πρό­σληψη παρουσίασαν τα καλλιεργη­θέντα δερματικά μοσχεύματα που είχαν τοποθετηθεί απευθείας επά­νω στην απονεύρωση των μυών α­μέσως μετά την απομάκρυνση της νεκρωτικής εσχάρας. Το σημαντι­κότερο αίτιο της αποτυχίας πρό­σληψης των καλλιεργηθέντων κε­ρατινοκυττάρων ήταν κατά την ά­ποψη του συγγραφέα, η μόλυνση του τραύματος. Επίσης, η ιστολογική εξέταση μετά από μερικούς μήνες έδειξε την ύπαρξη δέρματος με όλες τις στοιβάδες της επιδερ­μίδας, συμπεριλαμβανομένης της κοκκιώδους και της κερατίνης στοιβάδας χωρίς όμως αδενικά ε­ξαρτήματα. Το πάχος της επιδερ­μίδας ήταν λίγο λεπτότερο από ό­τι στο φυσιολογικό δέρμα, ενώ τα κύτταρα της βασικής στοιβάδας παρουσίαζαν επιπέδωση. Στη συ­νέχεια, οι O'Connor και Gallico²⁸ μετά από τρία χρόνια χρησιμοποίη­σαν πάλι καλλιεργηθέντα κερατι­νοκύτταρα για να επικαλύψουν ε­γκαύματα σε τρεις μικρούς α­σθενείς.

Οι καλλιέργειες κερατινοκυτ­τάρων έγιναν ευρύτερα γνωστές το1984, όταν ο Gallico²⁹ ανακοίνωσε στο New England Medical Journal την επιτυχή εφαρμογή τους για την επικάλυψη εκτεταμένων εγκαυμά­των >95% επιφάνειας σώματος σε δυο παιδιά που χειρουργήθηκαν στο Shriners Burns Institute της Μασαχουσέτης. Με τα καλλιεργη­θέντα δερματικά αυτομοσχεύματα καλύφθηκαν με επιτυχία 60-80% α­πό τις εγκαυματικές επιφάνειες των δυο παιδιών. Τα καλλιεργηθέ­ντα δερματικά αυτομοσχεύματα που αποτελούνταν από 2-8 στοιβά­δες κερατινοκυττάρων, είχαν τοπο­θετηθεί απευθείας στην απονεύρω­ση των μυών, αφού είχε προηγηθεί εκτομή των νεκρωμάτων και προ­σωρινή επικάλυψη με δερματικά ο­μοιομοσχεύματα. Ιστολογικά, μετά την τοποθέτηση και πρόσληψή τους, τα καλλιεργηθέντα κερατινο­κύτταρα αποκτούσαν το φυσιολογι­κό πάχος της επιδερμίδας με όλες τις στοιβάδες της χωρίς όμως τις θηλωματώδεις προσεκβολές. Επίσης, παρατηρήθηκε η ύπαρξη βασι­κής μεμβράνης καθώς και μερικών μελανοκυττάρων, ενώ ο συνδετικός ιστός κάτωθεν της επιδερμίδας ή­ταν φυσιολογικός με ομαλά κατα­νεμημένες ίνες κολλαγόνου τύπου Ι καθώς και αγγεία με τυχαία κατα­νομή. Ελαστικές ίνες δεν παρατη­ρήθηκαν.

Έκτοτε, καλλιέργειες κερατι­νοκυττάρων έχουν χρησιμοποιηθεί με άλλοτε άλλη επιτυχία και σε άλ­λα κέντρα πλην της Βοστόνης για κάλυψη εκτεταμένων εγκαυ­μάτων.^24.25.30-34 Χαρακτηριστικά, οHerzog³² σε μια σειρά 8 ασθενών α­ναφέρει πρόσληψη των καλλιεργη­θέντων επιδερμικών κυττάρων από Ο% μέχρι 85%.

Πλην των εγκαυμάτων, καλ­λιεργηθέντα κερατινοκύτταρα έ­χουν χρησιμοποιηθεί και σε άλλες περιπτώσεις όπως για την επικάλυ­ψη δερματικών διαβρώσεων σε α­σθενείς με πομφολυγώδη επιδερ­μόλυση,³⁵ σε δερματικές εξελκώ­σεις ποικίλης αιτιολογίας,³⁶ σε με­τεγκαυματικές ουλές που είχε προηγηθεί δερματική απόξεση²⁵ καθώς και για την κάλυψη χειρουρ­γικών τραυμάτων μετά από εκτο­μές γιγάντιων μελαγχρωματικώνσπίλων.³⁷

3.1. Καλλιέργειες αλλογενών κυττάρων

Πλην των καλλιεργειών αυτο­γενών επιδερμικών κυττάρων έ­χουν καλλιεργηθεί και αλλογενή κερατινοκύτταρα, δηλαδή κερατι­νοκύτταρα άλλα πλην αυτών του ξενιστή και συγκεκριμένα από άλ­λο άνθρωπο. Οι λόγοι που χρησι­μοποιούνται καλλιέργειες αλλογε­νών κερατινοκυττάρων είναι: πρώ­το, τα ανθρώπινα κύτταρα που λαμβάνονται μετά από καλλιέρ­γεια έχουν μικρή μόνο αντιγονικό­τητα και έτσι μειώνονται οι πιθανό­τητες απόρριψής τους.³⁸ Δεύτερο, δεν υπάρχουν στα καλλιεργηθέ­ντα αλλογενή μοσχεύματα, τα κύτ­ταρα του Langerhans που φαίνεται ότι καταστρέφονται ολοσχερώς κατά την εξεργασία της καλλιέρ­γειας. Όπως είναι γνωστό, τα κύτ­ταρα του Langerhans θεωρούνται οι κύριοι φορείς αντιγόνων στην ε­πιδερμίδα και ενοχοποιούνται κα­τά κύριο λόγο για την αντίδραση απόρριψης των δερματικών ομοιο­μοσχευμάτων.

Καλλιέργειες αλλογενών κε­ρατινοκυττάρων έχουν χρησιμο­ποιηθεί για την κάλυψη μερικού και ολικού πάχους εγκαυμάτων,^39,40δοτριών περιοχών,⁴¹ εξελκώσεων σε πομφολυγώδη επιδερμόλυση,⁴² χειρουργικών τραυμάτων μετά α­πό εκτομές κακοήθους μελανώ­ματος.⁴³ Οι αλλογενείς καλλιέρ­γειες κερατινοκυττάρων έχουν α­ποδειχθεί ιδιαίτερα χρήσιμες για την κάλυψη μικρών δερματικών ελ­λειμμάτων και κυρίως χρονίων εξελκώσεων^44-46 που ανθίστανται σε οποιαδήποτε άλλη θεραπευτική αγωγή. Αν και σε αυτές τις περι­πτώσεις δεν υπάρχει πρόβλημα περιορισμένων δοτριών περιοχών, η επικάλυψη της εξέλκωσης με καλλιεργηθέντα αλλογενή μο­σχεύματα μειώνει την ανάγκη λή­ψης μοσχεύματος και τη δημιουρ­γία ενός πρόσθετου τραύματος σε άτομα κατά το πλείστον μεγάλης ηλικίας που παρουσιάζουν σοβαρά προβλήματα επούλωσης. Τα καλλιεργηθέντα αλλογενή κερατινο­κύτταρα φαίνεται ότι συμβάλλουν στην επούλωση διεγείροντας την επιθηλιοποίηση, ενώ ταυτόχρονα ο ασθενής ανακουφίζεται από τον πόνο. Αν και τα ευεργετικά αποτε­λέσματα των καλλιεργηθέντων αλ­λογενών κερατινοκυττάρων είναι σημαντικά, τελικά διαπιστώθηκε ό­τι αυτά δεν προσφέρουν παρά προ­σωρινή μόνο επικάλυψη. Κι αυτό, διότι με την πάροδο του χρόνου τα αλλογενή κύτταρα αντικαθίστα­νται από κύτταρα του ξενιστή.

Η μόνιμη επικάλυψη εκτετα­μένων εγκαυμάτων ολικού πάχους με αλλογενείς καλλιέργειες κερα­τινοκυττάρων αποτελεί πρόκληση για τους ερευνητές που ακόμα διερευνάτε Αυτή η δυνατότητα, θα οδηγούσε στη δημιουργία τραπε­ζών δέρματος για την άμεση επι­κάλυψη εκτεταμένων ολικού πά­χους εγκαυμάτων, χωρίς να αναμέ­νεται το κρίσιμο χρονικό διάστημα των 3-4 εβδομάδων που συνήθως απαιτείται για την καλλιέργεια αυ­τογενών κερατινοκυττάρων. Βέβαια, σε αυτές τις περιπτώσεις δεν θα πρέπει να παραγνωρίζεται ο κίνδυνος μεταβίβασης των ιών ΗIV⁴⁷ και της ηπατίτιδας Β.

3.2. Πλεονεκτήματα­  Μειονεκτήματα

Οι καλλιέργειες των δερματι­κών αυτομοσχευμάτων έχουν απο­δειχθεί σωτήριες για τη ζωή ασθε­νών με λίαν εκτεταμένα ολικού πά­χους εγκαύματα, αφού με αυτή τη μέθοδο εξασφαλίζονται μέσα σε έ­να εύλογο χρονικό διάστημα σχε­δόν απεριόριστες ποσότητες δέρ­ματος. Τα καλλιεργηθέντα δερμα­τικά αυτομοσχεύματα φαίνεται ό­τι αντέχουν στο χρόνο και επίσης ότι αποκτούν με την πάροδο του χρόνου την ίδια ανατομική δομή και λειτουργικότητα του φυσιολο­γικού δέρματος.^1,48

Τα μειονεκτήματα της μεθό­δου είναι: 1. Ο ελάχιστος χρόνος που απαιτείται για την καλλιέργεια των κυττάρων είναι τουλάχιστον 2 εβδομάδες αλλά σπάνια αυτό συμ­βαίνει, αφού τις περισσότερες φο­ρές απαιτούνται περισσότερο από 4 εβδομάδες.⁴⁹ Κατά το μακρύ αυ­τό χρονικό διάστημα είναι δυνατόν ο εγκαυματίας να παρουσιάσει ε­πικίνδυνες για τη ζωή του επιπλο­κές και η γενική κατάσταση της υ­γείας του να επιδεινωθεί ανεπα­νόρθωτα. 2. Οι νησίδες των καλ­λιεργηθέντων κερατινοκυττάρων που παράγονται στο εργαστήριο είναι πολύ εύθρυπτες με αποτέλε­σμα να καταστρέφονται εύκολα πριν αλλά και κατά τη διάρκεια τηςμεταμόσχευσης.^1,49 Γι' αυτό, απαι­τείται μεγάλη προσοχή στο χειρι­σμό τους τόσο από την ομάδα του εργαστηρίου όσο και από τους χει­ρουργούς που θα τα τοποθετή­σουν. Λόγω της μεγάλης αυτής ευ­αισθησίας, αποκλείεται και η χρη­σιμοποίηση αμέσως μετά την ε­φαρμογή τους τοπικών αντισηπτι­κών.³¹ 3. Για να προσληφθεί το καλ­λιεργηθέν δερματικό αυτομόσχευ­μα απαιτούνται περισσότερο από ιδανικές συνθήκες της εγκαυματι­κής επιφάνειας που πρέπει να είναι καθαρή, ελεύθερη μικροβίων και καλά αγγειούμενη. Έχει ήδη απο­δειχθεί ότι τα καλλιεργηθέντα κε­ρατινοκύτταρα ευδοκιμούν ευκολό­τερα όταν αφαιρεθεί όλος ο νεκρω­μένος ιστός και το υποδόριο και αυ­τά τοποθετηθούν απευθείας επάνω στην απονεύρωση των μυών.^25,32 Η εκτομή όμως μέχρι την απονεύρω­ση έχει το μειονέκτημα ότι αφαι­ρούνται και όλα τα τυχόν διασωθέ­ντα αδενικά στοιχεία με αποτέλε­σμα να αποκλείεται η αναγέννηση επιθηλίου από αυτά. Πρόσθετα, προκύπτει έλλειμμα ιστού που θα πρέπει να συμπληρωθεί με την πα­ραγωγή καινούργιου χορίου.⁴ Η παραγωγή νέου συνδετικού ιστού (χορίου) από τους παρακείμενους ι­στούς αποτελεί μια μακρά διεργα­σία που δεν συμπληρώνεται παρά μόνο αφού περάσουν 5-6 μήνες.

Έτσι, είναι δυνατόν κατά τη διάρκεια αυτή ο άρρωστος να δια­πιστώσει μια αυξημένη ευθρυπτό­τητα του μεταμοσχευθέντος δέρ­ματος καθώς και μια ελαττωμένη πρόσφυση της επιδερμίδας στο χόριο με αποτέλεσμα το δέρμα να απομακρύνεται εύκολα με την ελά­χιστη τριβή.⁵⁰ Η τεχνική της καλ­λιέργειας των κερατινοκυττάρων θεωρείται αρκετά πολύπλοκη, πο­λυδάπανη, απαιτεί υψηλή εξειδί­κευση του προσωπικού και οργά­νωση εργαστηρίου.

4. Σύνθετα μοσχεύματα χορίου και καλλιεργηθέντων κερατινοκυττάρων

Το 1952 οι Billingham και Reynolds²¹προέβλεπαν ότι τα επι­δερμικά κύτταρα δεν μπορούν να αποτελέσουν τον ιδανικό τρόπο κάλυψης των εγκαυμάτων, εφόσον δε λαμβάνεται πρόνοια και για την αποκατάσταση του απολεσθέντος χορίου. Γι' αυτό επίστευαν ότι μα­ζί με τα καλλιεργηθέντα κερατινο­κύτταρα θα έπρεπε να συμπερι­λαμβάνονται και μεσεγχυματικά κύτταρα που θα είχαν την ικανότη­τα πολλαπλασιασμού και παραγω­γής ινών κολλαγόνου. Παράλληλα με τις προσπάθειες ανάπτυξης με­θόδων καλλιέργειας επιδερμικών κυττάρων, καταβλήθηκαν προσπά­θειες για την παραγωγή συνθετι­κού δέρματος που να αποτελείται από επιδερμίδα και χόριο. Η σημα­ντικότερη εργασία στον τομέα αυ­τό, προέρχεται από τον Γιαννιά του Τεχνολογικού Ινστιτούτου της Μασαχουσέτης.^51,52 Τα αποτελέ­σματά του ήταν μάλλον απογοη­τευτικά λόγω της πολύπλοκης αρ­χιτεκτονικής δομής του δέρματος καθώς και των ποικίλων λειτουρ­γιών του δέρματος που δύσκολα μπορούν να αναπαραχθούν στο ερ­γαστήριο.

Με την έναρξη εφαρμογής των καλλιεργειών των δερματικών αυτομοσχευμάτων έγινε γρήγορα αντιληπτό ότι αυτά παρουσιάζουν αυξημένη ευθρυπτότητα κυρίως κατά τους πρώτους μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Επίσης, στις περιοχές που εί­χαν καλυφθεί με καλλιεργηθέντα δερματικά αυτομοσχεύματα, η ρί­κνωση που παρατηρούνταν ήταν μεγαλύτερη, συγκριτικά προς πε­ριοχές που είχαν καλυφθεί με δι­κτυωτά δερματικά αυτομο­σχεύματα.

Έτσι, πολλοί ερευνητές εθεώ­ρησαν ότι θα ήταν προτιμότερο το προς επικάλυψη καλλιεργηθέν δέρμα να αποτελείται και από τα δυο στοιχεία που συνθέτουν το φυ­σιολογικό δέρμα, δηλαδή από επι­δερμίδα και από χόριο. Το χόριο, είναι που εξασφαλίζει καλύτερη και πιο σταθερή επικάλυψη και πα­ρεμποδίζει τη ρίκνωση του τραύ­ματος.^53,54 Ακόμη και όταν χρησιμο­ποιούνται μοσχεύματα μερικού πά­χους, αυτά πρέπει να περιλαμβά­νουν έστω και ένα ελάχιστο ποσό χορίου.

Εξάλλου, η κλινική πείρα έδει­ξε ότι όσο περισσότερο παχύ είναι το μόσχευμα μερικού πάχους, τό­σο μεγαλύτερη είναι η ανθεκτικό­τητά του στις κακώσεις. Αφού έγι­νε κατανοητή η μεγάλη σημασία του χορίου για την εξασφάλιση σταθερότητας στο μόσχευμα, οι προσπάθειες επικεντρώθηκαν στην παραγωγή σύνθετου μοσχεύ­ματος που θα αποτελούνταν, πρώ­τον από χόριο που θα λαμβανόταν είτε από πτώματα είτε θα παραγό­ταν στο εργαστήριο και δεύτερον από καλλιεργηθέντα κερατινο­κύτταρα.

Ο Bell και οι συνάδελφοί του(1981)⁵⁵ δημιούργησαν στο ερ­γαστήριο ένα ισοδύναμο δέρματος που αποτελούνταν και από τα δυο στοιχεία που συνθέτουν το δέρμα, δηλαδή από επιδερμίδα και χόριο.

Ο Woodley⁵⁰το 1988 έκανε ευ­ρύτερα γνωστή την άποψη ότι τα κερατινοκύτταρα που λαμβάνο­νταν μετά από καλλιέργεια ήταν ι­διαίτερα ευαίσθητα στη μηχανική κάκωση και ως εκ τούτου ανεπαρ­κή. Ο ίδιος μελέτησε 4 εγκαυμα­τίες που καλύφθηκαν τα εγκαύμα­τά τους με καλλιεργηθέντα δερμα­τικά αυτομοσχεύματα και διαπί­στωσε αυξημένη ευθρυπτότητα των περιοχών που καλύφθηκαν με καλλιεργηθέντα δερματικά αυτο­μοσχεύματα. Τρεις μάλιστα από τους εγκαυματίες παραπονέθηκαν και για ανάπτυξη φλυκταινών. Η εξέταση με το ηλεκτρονικό μικρο­σκόπιο έδειξε την ανεπαρκή ανά­πτυξη βασικής μεμβράνης κάτω­θεν των αυτομοσχευμάτων, ενώ υ­πήρχε παντελής απουσία των συν­δετικών ινιδίων της βασικής μεμ­βράνης (anchoring fibrils). Ο Woodley κατέληξε στο συμπέρα­σμα ότι η αυξημένη ευθρυπτότητα που μπορεί να διαρκεί μέχρι και 7 μήνες μετά τη μεταμόσχευση, ο­φείλεται κατά κύριο λόγο στην α­πουσία αυτών των συνδετικών ι­νιδίων.

Σημαντική είναι και η συμβο­λή του Cuono που χρησιμοποίησε κατεψυχθέντα δερματικά ομοιομο­σχεύματα που είχε προηγηθεί από­ξεση της επιδερμίδας για να καλύψει εγκαυματικές επιφάνειες. Στη συνέχεια, το χόριο καλυπτόταν με καλλιέργειες αυτογενών κερατι­νοκυττάρων.^56,57Το χόριο δεν α­πορρίπτεται λόγω απουσίας αντι­γονικότητας από τα στοιχεία που το συνθέτουν. Τα μεσεγχυματικά δε κύτταρα του χορίου, με την πά­ροδο του χρόνου αντικαθίστανται από κύτταρα του ξενιστή.

Ο Hansbroughs⁵⁸κατόρθωσε να παράγει στο εργαστήριο δέρμα που αποτελούνταν από επιδερμίδα και χόριο. Το χόριο συνίστατο από ένα δίκτυο βοείων ινών κολλαγό­νου ανάμεικτο με γλυκοαμινογλυ­κοσίδες που αποτελούσαν τη θεμέ­λια ουσία του χορίου. Η θεμέλια αυτή ουσία διασπειρόταν από ινο­βλάστες που είχαν ληφθεί από τον εγκαυματία και είχαν καλλιεργηθεί στο εργαστήριο. Στη συνέχεια, το­ποθετούνταν επάνω σε μεμβράνη από κολλαγόνο-γλυκοαμινογλυ­κοσίδες, τα καλλιεργηθέντα αυτο­γενή κερατινοκύτταρα.

Παρά τις προσπάθειες για την παραγωγή σύνθετων μοσχευμά­των^56,58,59 τα τεχνικά προβλήματα φαίνεται να είναι τόσο μεγάλα ώ­στε ακόμη να μην έχουν καθιερω­θεί και γίνει ευρύτερα γνωστά. Εν­δεχομένως, αφού λυθούν όλα τα προβλήματα με τις καλλιέργειες των δερματικών αυτομοσχευμά­των, η προσοχή των ερευνητών να στραφεί εξ ολοκλήρου προς τα σύνθετα μοσχεύματα που μοιά­ζουν περισσότερο προς το φυσιο­λογικό δέρμα.

5. Αποτελέσματα

     Η επιτυχής πρόσληψη των καλλιεργειών των δερματικών αυ­τομοσχευμάτων ποικίλλει σημαντι­κά στους διάφορους συγγραφείς. Ο Gallico³⁷ σε μια σειρά 8 ασθενών με γιγάντιους μελαγχρωματικούς σπίλους που αντιμετωπίσθηκαν με εκτομή και άμεση μεταμόσχευση, αναφέρει ότι η μέση πρόσληψη των καλλιεργειών των δερματικών αυτομοσχευμάτων ήταν 68%, ενώ των δικτυωτών δερματικών αυτο­μοσχευμάτων 84%. Ας σημειωθεί ότι οι Gallico και O'Connor, δίνουν σε όλες τις σειρές τους τα καλύτε­ρα αποτελέσματα όσον αφορά τα ποσοστά πρόσληψης, εν αντιθέσει προς άλλους συγγραφείς που ανα­φέρουν μικρότερα ποσοστά επιτυ­χίας ή ακόμη και απογοητευτικά α­ποτελέσματα των καλλιεργειών των δερματικών αυτομοσχευμά­των.^24,32,60,61Η επιτυχία της τεχνι­κής εξαρτάται από πολλούς παρά­γοντες, όπως είναι η εξειδίκευση του κέντρου, η ηλικία του ασθε­νούς, η κατάσταση της υγείας του εγκαυματία, η περιοχή που λαμβά­νονται οι βιοψίες δέρματος. Μεγά­λη έμφαση δίνεται και στις προϋ­ποθέσεις που θα πρέπει να εκπλη­ροί η περιοχή που θα δεχθεί τα καλλιεργηθέντα κύτταρα. Φαίνε­ται, ότι τα καλλιεργηθέντα κερατι­νοκύτταρα προσλαμβάνονται κα­λύτερα όταν τοποθετηθούν απευ­θείας επάνω στην απονεύρωση των μυών αμέσως μετά την εκ­τομή των νεκρωτικών εσχα­ρών^{25,29,32,33,37} ή σε υγιή κοκκιώδη ι­στό που είχε προηγουμένως προ­ετοιμασθεί κατάλληλα με δερματι­κά πτωματικά ομοιομοσχεύμα­.^28,29,3l Αντίθετα, η πρόσληψη δεν είναι καλή όταν τα καλλιεργηθέντα κερατινοκύτταρα τοποθετηθούν ε­πάνω σε χρόνιο κοκκιώδη ιστό. Κα­τά τον O'Connor,⁶² τα αίτια της α­ποτυχίας των καλλιεργειών των δερματικών αυτομοσχευμάτων εί­ναι α. η ανεπαρκής προετοιμασία της δέκτριας περιοχής β. η μόλυν­ση της τραυματικής επιφάνειας ό­πως παρατηρείται στον χρόνιο κοκκιώδη ιστό και γ. η τριβή ή η ά­σκηση υπερβολικής πίεσης επάνω στο μόσχευμα.

Σχετικά με την ανάπτυξη υ­περτροφικών ουλών φαίνεται ότι αυτή είναι μικρότερη στα καλλιερ­γηθέντα δερματικά αυτομοσχεύ­ματα από ότι στα δικτυωτά δερμα­τικά αυτομοσχεύματα.^62,63 Τα καλ­λιεργηθέντα δερματικά μοσχεύμα­τα έχουν μια απαστράπτουσα όψη, είναι λεπτά και καθηλωμένα, ενώ με την πάροδο του χρόνου γίνο­νται περισσότερο μαλακά και είναι δυνατόν στην επιφάνειά τους να παρατηρηθούν ακόμα και ελαφρές ρυτί­δες. Αντίθετα, τα δικτυωτά δερμα­τικά αυτομοσχεύματα εκτός του ό­τι διατηρούν τη δίκην «πλακοστρώ­του» όψη τους, συχνά παρατηρεί­ται στο όριο μετάπτωση ς του δι­κτυωτού μοσχεύματος με το υγιές δέρμα, ανάπτυξη υπερτροφικής ουλής.

Αντίθετα, η ρίκνωση φαίνεται να επισυμβαίνει σε μεγαλύτερο βαθμό στις επιφάνειες που έχουν καλυφθεί με καλλιεργηθέντα κερα­τινοκύτταρα από ότι στις επιφά­νειες που έχουν καλυφθεί με τα δι­κτυωτά δερματικά αυτομοσχεύ­ματα.² Η ρίκνωση της επικαλυφθεί­σας με καλλιεργηθέντα μοσχεύμα­τα περιοχής, πιστεύεται ότι εξαρ­τάται από την περιοχή του σώμα­τος που καλύπτεται. Η οπίσθια ε­πιφάνεια του κορμού και η κοιλία, φαίνεται ότι παρουσιάζουν μεγα­λύτερου βαθμού ρίκνωση συγκρι­τικά προς άλλες περιοχές του σώ­ματος, όταν καλυφθούν με μοσχεύ­ματα κερατινοκυττάρων.³⁷

6. Συμπεράσματα

Οι καλλιέργειες κερατινοκυτ­τάρων έχουν αποδειχθεί σωτήριες για τη ζωή ασθενών με εκτεταμέ­να εγκαύματα. Παρ' όλα αυτά, η ευρεία χρησιμοποίησή τους ακόμη και σε μεγάλα κέντρα εγκαυμάτων, δεν έχει καθιερωθεί λόγω του με­γάλου κόστους, της υψηλής εξει­δίκευσης που απαιτείται καθώς και του μεγάλου χρόνου για την καλ­λιέργεια των κυττάρων. Στην περί­πτωση που χρησιμοποιηθούν καλ­λιέργειες αλλογενών κερατινοκυτ­τάρων για την κάλυψη κυρίως μι­κρών εξελκώσεων, δε θα πρέπει να παραγνωρίζεται ο κίνδυνος μετα­βίβασης του ιού του Συνδρόμου της Επίκτητης Ανοσοποιητικής Α­νεπάρκειας.

    Από τα διάφορα κέντρα που ε­φαρμόζονται οι καλλιέργειες των αυτογενών επιδερμικών μοσχευ­μάτων, υπάρχουν αλληλοσυγκρου­όμενα αποτελέσματα όσον αφορά τη μακροβιότητα, την ανθεκτικότη­τα και το ικανοποιητικό αισθητικό αποτέλεσμά τους συγκρινόμενα με τα δερματικά αυτομοσχεύματα με­ρικού πάχους. Η τελική προσθήκη ενός λειτουργικού χορίου που να μοιάζει γενετικά προς το ανθρώπι­νο, καθώς και η βελτίωση της τε­χνικής για την επιτάχυνση της πα­ραγωγής των κερατινοκυττάρων, θα αποτελέσουν μια ακόμη σημα­ντική πρόοδο στη διάσωση των ε­γκαυματιών με λίαν εκτεταμένα εγκαύματα.² Τελικά, μετά την επί­λυση όλων των επί μέρους προ­βλημάτων, οι καλλιέργειες κερατι­νοκυττάρων ενδέχεται να αποτε­λέσουν τον μοναδικό τρόπο επικά­λυψης των εγκαυματικών επιφανειών.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Wood/ey DΤ: Covering wounds with cultured keratinocytes. JAMA 1989, 62: 2140-2141.

2. Fisher JC: Skin-the ultimate solu­tion for the burn wound. Ν. Engl. J. Med. 1984, 311:466-467.

3. Phillips TJ: Cultured skin grafts: past, present, future. Arch. Derma­tol. 1988, 124:1035-1038.

4. TannerJCJr, VandepυtJ, OlleyJF: The mesh skin graft. Plast. Reconstr. Surg. 1964, 34:287-292.

5. Κρητικάς Σ, Κόνωνας Θ, Βαλσαμί­δης Σ: Αντιμετώπιση εκτεταμένων εγκαυμάτων. Ελλ. Χειρ. 1982, 54: 183-192.

6. Bardack WM, Martin ΜΜ, Jewett TC, Boyer ΒΕ: Synthetic substitutes for skin. Plast. Reconstr. Surg. 1962, 30: 554-567.

7. Matter Ρ, Barclay ΤΙ, Konickova Zedts: Research in burns. Transac­tions of the Third International Con­gress on Research on burns. Stutt­gart, Vienna: Hans Huber, 1970.

8. Bondoc CC, Burke JF: Clinical experience with viable frozen human skin and frozen skin bank. Ann. Surg. 1971, 174: 371-382.

9. Matolsty AG: Epidermal cells in cul­ture. Int. Αθν. Cytol. 1960, 10:315-351.

10. Karasek ΜΑ: Growth and differen­tiation of transplanted epithelial cell cultures. J. Invest. Dermatol. 1968, 51 :247-252.

11. Freeman ΑΕ, Igel HJ, Walman ΝΙ, Losikoff ΑΜ: Α new method for covering large surface area wounds with autografts. Ι. In νίνο multipli­cation of rabbit-skin epithelial cells. Arc. Surg. 1974, 108:721-723.

12. Fusenig ΝΕ, Wosrt ΡΚΜ: Mouse epidermal cultures. Ι. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J. Inves. -Derma­tol. 1974, 63: 187-193.

13. Ιίυ SC, Karasek Μ: Isolation and serial cultivation of rabbit skin θρί­thelial cell. J. Inves. Dermatol. 1978, 70:288-293.

14. Marcelo CL, Kim JL, Voorhess JJ: Stratification, specialization and proliferation of primary kerati­nocyte cultures. Evidence of func­tioning in vitro epidermal cell system. J. Cell Βίοl. 1978, 97:356-370.

15. Medawar ΡΒ: The cultivation of adult mammalian skin epithelium in vitro. Q. J. Microsc. Sci. 1948, 187-196.

16. Igel HJ, Freeman ΑΕ, Boeckman CR, Kleinfeld ΚΙ: Α new method for covering large surface area wounds with autografts. 11. Surgical applica­tions of tissue culture expanded rabbit-skin autograft. Arc. Surg. 1974, 108:724-729.

17. Rheinwald JC, Green Η: Serial cul­tivation of strains of human epider­mal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975, 6:331-344.

18. Rheinwald JG, Green Η: Epidermal growth factor and the multipli­cation of cultured human epidermal ketatinocytes. Nature 1977, 265:421-424.

19. Green Η, Kehinde Ο, Thomas J: Growth of cultured human epider­mal cells into multiple epithelia sui­table for grafting. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1979, 76:5665-5668.

20. Eisenger Magdalena, Monden Μ, Raaf JF, Phil Ο, Fortner J: Wound coverage by a sheet of epidermal cells grown in vitro from dispersed single cell preparations. Surgery 1980,88:287-293.

21. Bi//ingham RE, Reynolds J: Trans­plantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions. Br. J. Plast. Surg. 1952, 5:25-36.

22. Medawar ΡΒ: Stleet$ of epidermal epithelium from human skin. Nature (London) 1941, 148:783-784.

23. Ga//ico GG, O'Connor ΝΕ: Cultured epithelial as skin substitutes. Clin. Plast. Surg. 1985, 12(2):149-157.

24. Latarjet J, Gaggolphe Μ, Hezez G, et al: The grafting of burns with cul­tured epidermis as autografts in man. Two cases reports. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg-Hand Surg. 1987, 21(3): 241-244.

25. Kumagai Ν, Nishina Η, Tanabe Η,Hosaka Τ, Ishida Η, Ogino Υ.: Cli­nical application of autologous cul­tured epithelia for the treatment of burn wounds and burn scars. Plast. Reconstr. Surg. 1988, 82:99-108.

26. Breidahl AF, Judson RT, Clunie GJA: Review of keratinocyte culture techniques: problems of growing skin. Aust. Ν. l. J. Surg. 1989, 59:485-497.

27. O'Connor ΝΕ, Mu//iken JB, Banks­Schlegel S, Kehinde Ο, Green Η: Grafting of burns with cultured epi­thelium prepared from autologous epidermal cells. Lancet 1981, 1 :75-78.

28. O'Connor ΝΕ, Ga//ico GG, Compton CC, Kehinde Ο, Green Η: Grafting of burns with cultured epithelium prepared form autologous epider­mal cells. II. Intermediate term results on three pediatric patients. In: Hunt ΤΚ, Heppenstall ΚΒ, Pines Ε, Rovee D. eds. Soft and hard tis­sue repair: biological and clinical aspects. νοl 2. New York: Praeger Scientific. 1984:283-292.

29. Ga//ico GG, O'Connor ΝΕ, Compton CC, Kehinde Ο, Green Η: Perma­nent coverage of burn wounds with autologous cultured human epithe­lium. Ν. Engl. J. Med. 1984, 311 :448-451.

30. Pittlekow MR, Scott RE: New techi­ques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and pers­pectives on their use for grafting patients with extensive burns. Mayo Clin. Proc. 1986,61:771-777.

31. Teepe RGC, Ponec Μ, Kries RW, Hermans RP: Improved grafting method for treatment of burns with autologous cultured human epithe­lium (Ietter). Lancet 1986, 1:385.

32. Herzog SR, Meyer Α, Woodley Ο, Peterson ΗD: Wound coverage with cultured autologous keratinocytes: use after burn wound excision, including biopsy follow-up. J. Trauma 1988, 28(2): 195-198.

33. De Luca Μ, Albanese E,Bondanza S, et al: Multicentre experience in the treatment of burns with autolo­gous and allogenic cultured epithe­lium, fresh or preserved in a frozen state. Burns 1989, 15:303-309.

34. Teepe RGC, Kreis RW, Koebrugge EJ, et al: The use of cultured auto­logous epidermis in the treatment of extensive burn wounds. J. Trauma 1990,30:269-275.

35. Carter DΜ, Lίπ ΑΝ, Varghese MC, Caldwe// Ο, Pratt ΙΑ, Eisenger Μ: Treatment of junctional epidermoly­sis bulosa with epidermal auto­grafts. J. Amer. Acad. Dermatol. 1986, 17:246-250.

36. Hefton JM, Caldwe// Ο, Biozes Ο, Balin ΑΚ, Carter DΜ: Grafting of skin ulcers with cultured autolo­gous epidermal cells. J. Amer. Acad. Dermatol. 1986, 14:399-405.

37. Ga//ico GG, O'Connor ΝΕ, Compton CC, Remensnyder JP, Kehinde O:Green Cultured epithelial auto­grafts for giant congenital nevi. Plast. Reconstr. Surg. 1989,84:1-9.

38. Morhenn VB, Benike CJ, Cox AJ, Charron DJ, Englemann AG: Cultu­red human epidermal cells do not synthesize HLA-DR. J. Invest. Der­matol. 1982, 778:332-337.

39. Hefton JM, Madden MR, Fingels­tein JL, Shires GT: Grafting of burn patients with allografts of cultured epidermal cells. Lancet 1983, 1 :428-430.

40. Madden MR, Fingelstein JL, Staiano-Coico Ι, Goodwin CW, Shires GT, No/an Εξ Hefton JM: Graf­ting of cultured allogenic epidermis οπ second and third degree burn wounds. J. Trauma 1986, 26: 955-962.

41. Thivo/et J, Faure Μ, Demidem Α, Mauduit G: Long term survival and immunological tolerance of human epidermal allografts produced ίπ culture. Transplantation 1986, 42: 274-280.

42. Eisenberg Μ, L/ewe//yn ΟΜ, Moran K,Kerr Α: Successful engraftment of cultured human epidermal allo­grafts ίπ a child with recessive dystropj1ic epidermolysis bullosa (Letter). Med. J. Aust. 1987, 147: 520-521.

43. Aubock J, /rschick ξ Romani Ν, et a/: Rejection, after a slightly prolonged survival time, of Lange­

rhans cell-free cultured epidermis' used for wound coverage ίπ humans. Transplantation 1988,45: 730-737.

44. Leigh /Μ, Purkis Ρξ Navsaria ΗΑ, Phi//ips Τ J: Treatment of chronic venous ulcers with sheets of cultu­red allogenic keratinocytes. Br. J. Dermatol. 1987, 117: 591-597.

45. Phi//ips Τ J, Kehinde Ο, Green Η, Gίlchrest ΒΑ: The Treatment of Skin Ulcers with Cultured Epidermal Allografts. J. Am. Acad. Dermatol. 1989,21: 191-199.

46. Phi//ips TJ, Gίlchrest ΒΑ: Cultured allogenic keratinocyte grafts ίπ the management of wound healing: prognostic factors. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1989, 15: 1169-1175.

47. C/arke JA: Ηιν transmission and ski n 9 rafts (Letter). Lancet 1987, 1: 983.

48. Compton C, Gi// JM, Bradford ΟΑ, Regauer S, Ga//ico GG, Ο’Connor ΝΕ: Skin regenerated from cultured epithelial autografts οπ full thick­ness burn wounds for 6 days to 5 years after grafting. Lab. Inves. 1989,60: 600-612.

49. Arons JA, Wainwright DJ, Jordon RE: The surgical applications and implications of cultured human epi­dermis: Α conlprehensive review. Surgery 1992, 111: 4-11.

50. Wood/eyDT, Peterson ΗΟ, Herzog SR, Stricklίn GP, Burgeson RE, Brig­gaman RA, Cronce DJ, O'Keefe EJ: Burn wounds resurfaced by cultu­red epidermal autografts show abnormal reconstitution of ancho­ring fibrils. JAMA 1988, 259(17): 2566-2571.

51. Jannas /V, Burke JF: Design of an artificial skin. Basic design princi­ples Ι. J. Biomed. Mater. Res. 1980, 14: 65-81.

52. Jannas /V, Burke JF, Gordon ΡΙ, Huang C, Rubinstein RH: Design of an artificialll. Control of chemical composition. J. Biomed. Mater. Res. 1980, 14: 107-131.

53. Brown JB, McDowe// F: Skin Graf­ting, 3rd EdPhiladelphia: Lippincott 1958, ρ.ρ. :62, 346-347.

54. Peacock ΕΕ Jr, Van Wink/e W: Sur­gery and Biology of Wound Repair. Philadelphia: Saunders, 1970 ρ.ρ: 381-404.

55. Be// E, Ehrlίch Ρ, Sher S, Μerill C, Sarber R, Ηυ// Β, Nakatsji Τ, Church D, Butt/e DJ: Development and Use of a Living Skin Equivalent. Plast. Reconstr. Surg. 1981, 67: 386-392.

56. Cuono CB, Langdon RL, Mc Guire J: Use of cultured epidermal auto­grafts and dermal allografts as skin replacement after burn injury. Lan­cet 1986, 1: 1123-1124.

57. Cuono CB, Langdon RL, Bircha// Ν, Bartelίbort S, McGuire J: Composite autologous-allogeneic skin replacement: development and cli­nical application. Plast. Reconstr. Surg. 1987, 80: 626-635.

58. Hansbrough JF, Boyce ST, Cooper ΜΙ, Foreman TJ: Burn wound clo­sure with cultured autologous kera­tinocytes and fibroblasts attached to a collagenglycosaminoglycan substrate. JAMA 1989, 262: 2125-2130.

59. Bonnekoh Β, Mahr/e G. Ste//enwert νοπ Dermis: Aquivalenten fur die Weiterentwicklung νοπ Wunddec­kungsverfahren mittels Keratino­zyten-Kulturen. l. Hautkr. 1990,65: 705-707.

60. E/dad Α, Burt Α, C/arke JA: Cultu­red epithelium as a skin substitute. Burns 1987, 13: 173-180.

61. Blίght Α, Mountford ΕΜ, Cheshire /Μ, C/ancy JM, Levick ΡΙ: Treat­ment of full thickness burn injury using cultured epithelial grafts. Burns 1991, 17: 495-498.

62. O’Connor ΝΕ, Ga//ico GG, Compton C, Briggs S, Remensnyder J: Cultu­red epithelial autografts ίπ the treat­ment of pediatric patients with major burns. Ιn Galligo GG, O'Con­nor ΝΕ, Green H(eds). Proceedings of an update Symposium οπ Cultu­red Epithelial Grafts ίπ Wound Clo­sure. Ν Orleans, April1989. Massa­chusetts General Hospital, Harvard Medical School, USA.

63. Teepe RGC, Koebrugge EJ, Kreis RW, Boxma Η, Ponec Μ, Vermeer BJ: Clinical use of cultured epithe­lial grafts. Ιπ Galligo GG, O'Connor ΝΕ, Green H(eds). Proceedings of an update Symposium οf Cultured Epithelial Grafts ίπ Wound Clo­sure.N Orleans, April1989. Massa­chusetts General Hospital, Harvard Medical School, USA.