Extracção de DNA genómico e RNA total

Neste trabalho proceder-se-á à extracção de DNA genómico e RNA total de várias linhas celulares derivadas de carcinomas humanos. A metodologia utilizada [1] permite a extracção simultânea de DNA e RNA de uma só amostra e corresponde, em termos gerais, à combinação de dois métodos clássicos de extracção separada de ácidos núcleicos: extracção de DNA pelo método “salt-chloroform” [2]; extracção de RNA pelo método “acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform” [3].

O DNA e RNA obtidos serão posteriormente utilizados para PCR e RT-PCR, respectivamente. O RNA é extremamente sensível a RNases e facilmente degradável. Por estas razões a manipulação das amostras e do material de laboratório tem que ser feita com o máximo cuidado: usar sempre luvas e mexer apenas no material indispensável; usar apenas material esterilizado; trocar sempre o material (nomeadamente pontas de pipeta) de forma a não provocar contaminações entre amostras.

CUIDADO!

O “TriPure isolation reagent” contem fenol (altamente tóxico e abrasivo) e guanidina-tiocianato (dermo-irritante). Proteger a pele e não respirar vapores!

MATERIAL

Amostras

Protocolo

I- Lise celular

1- A cada amostra (± 10⁶ células) adicionar 1 ml de reagente “TriPure”.

2- Lisar as células por pipetagem repetida.

3- Transferir e dividir o homogeneizado por dois tubos eppendorf de 1,5 ml (polipropileno – resistente aos químicos usados no processo de extracção).

II- Separação de fases

1- Incubar os homogeneizados à temperatura ambiente (TA) durante 5 mins (assegura a dissociação completa dos complexos núcleo-proteicos).

2- Adicionar 100 ml de clorofórmio acada amostra e agitar vigorosamente durante 15 segs.

3- Incubar à TA durante 10 mins.

4- Centrifugar as amostras a 12000xg, durante 15 mins, a 4⁰C.

5- Depois da centrifugação usar as diferentes fases da seguinte forma:

 - Transferir a fase aquosa superior (incolor) para um novo tubo eppendorf de 1,5 ml para isolar RNA. Tirar o máximo possível da fase aquosa com pipeta, mas sem contaminar com material da fase intermédia!

 - Guardar as fases intermédia (branca) e orgânica (vermelha) para isolar DNA.

III- Isolamento de RNA

1- Precipitar o RNA da solução aquosa através dos seguintes passos:

 - Adicionar 250 ml de isopropanol a cada amostra.

 - Inverter os tubos lentamente, várias vezes, de forma a misturar bem.

 - Incubar as amostras à TA durante 10 mins para permitir a precipitação do RNA.

 - Centrifugar as amostras a 12000xg, durante 10 mins, a 4⁰C.

2- Descartar o sobre-nadante (SN) e adicionar 500 ml de etanol 75% a cada amostra.

3- Usando a pipeta de 1 ml, e com muito cuidado, reunir as duas pellets de RNA de cada amostra no tubo eppendorf de uma delas.

4- Vortexar, ou agitar intensamente, as amostras.

5- Centrifugar as amostras a 7500xg, 5 mins, a 4⁰C.

6- Descartar o SN, centrifugar rapidamente e remover cuidadosamente o resto de etanol com pipeta.

7- Secar ao ar durante 10-15 mins.

8- Re-suspender o RNA em 20-100 ml de água tratada com DEP-C (Diethylpirocarbonate).

9- Dissolver o RNA por pipetagem repetida.

10- Armazenar as amostras a –70⁰C.

IV- Isolamento de DNA

1- A cada amostra adicionar 480 ml de SE e 60 ml de SDS 10%.

2- Homogeneizar bem as amostras por pipetagem repetida.

3- Verificar o pH da solução. Se for inferior a 8 ajustar,com NaOH 1M (± 50 ml).

4- Centrifugar a 12000xg, 10 mins, a 4⁰C.

5- Transferir a fase aquosa superior para novo tubo eppendorf de 1,5 ml. Guardar, temporariamente, as fases intermédia e orgânica.

6- Precipitar o DNA da solução aquosa através dos seguintes passos:

 - Adicionar 500 ml de isopropanol a cada amostra.

 - Inverter os tubos lentamente até se observar a precipitação do DNA. Se não ocorrer precipitação, centrifugar a 12000xg, durante 10 mins, a 4⁰C.

7- Usando a pipeta de 1 ml, e com muito cuidado, reunir as duas pellets de DNA de cada amostra num novo tubo eppendorf.

8- Adicionar 1 ml de etanol 75% a cada amostra e agitar devagar.

9- Centrifugar as amostras a 7500xg, 5 mins, a 4⁰C.

10- Descartar o SN e repetir a lavagem com etanol 75%.

11- Descartar o SN, centrifugar rapidamente e remover cuidadosamente o resto de etanol com pipeta.

12- Secar ao ar durante 10-15 mins.

13- Re-suspender o DNA em 20-100 ml de água esterilizada.

14- Armazenar as amostras a 4⁰C até à dissolução do DNA. Para armazenar a longo prazo, guardar a –70⁰C.

Bibliografia

1- Chomczynski P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.Biotechniques 15:532-536, 1993.

2- Mullenbach R, Lagoda PJ, Welter C. An efficient salt-chloroform extraction of DNA from blood and tissues.Trends. Genet. 5:391, 1989.

3- Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal. Biochem. 162:156-159, 1987.

Últimas modificações: 19-06-2003

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