Estudo de perda de heterozigotia em 1p36 em neuroblastomas humanos: amplificação por PCR do marcador D1S80.

O objectivo deste trabalho é analisar perdas de heterozigotia (LOH) na região cromossómica 1p36 em neuroblastomas humanos.

O neuroblastoma é uma neoplasia do sistema nervoso periférico que ocorre em crianças até aos 5-6 anos. Entre as várias alterações genéticas identificadas em neuroblastomas uma das mais frequentes é a deleção da região cromossómica 1p36 [1,2]. Em neuroblastomas, esta deleção está significativamente associada a pior sobrevida dos doentes (Fig. 1).

Fig. 1: Curvas de sobrevida de doentes com neuroblastoma, com e sem perda de heterozigotia em 1p.

De forma simplificada os genes envolvidos no processo neoplásico podem ser divididos em dois grandes grupos: oncogenes e genes supressores tumorais. Esta classificação é baseada no mecanismo de acção destes genes na tumorigénese: os oncogenes sofrem alterações dominantes activadoras que levem a ganho de função; os genes supressores tumorais sofrem alterações recessivas inactivadoras, que levam a perda de função. Assim, e por definição, a activação de um oncogene necessita de um só evento genético, enquanto a inactivação de um gene supressor tumoral necessita de dois eventos genéticos (Fig. 2). Frequentemente, a deleção de regiões cromossómicas é um desses eventos e indica a presença de um gene supressor tumoral (muitas vezes não identificado) nessa região ou na sua proximidade; o evento genético responsável pela inactivação do outro alelo é, frequentemente, a mutação pontual ou a repressão da expressão génica por, por exemplo, metilação do promotor do gene.

Fig. 2: São necessários dois eventos genéticos para a inactivação do gene do retinoblastoma (RB).

Os estudos de LOH permitem identificar a deleção de determinadas regiões cromossómicas através da utilização de um ou mais marcadores genéticos localizados nessa mesma região. O requisito fundamental para este tipo de estudo é que o indivíduo analisado seja informativo, isto é, heterozigótico para os marcadores escolhidos. Desta forma é possível distinguir os dois alelos de um marcador em DNA normal do indivíduo e, por comparação, determinar se ocorre perda, ou não, de um dos alelos no DNA tumoral. A verificar-se esta perda, diz-se que ocorre perda de heterozigotia ou redução à homozigotia. Como é óbvio, estes estudos são tanto mais efectivos quanto mais heterozigóticos e mais próximos do gene supressor tumoral forem os marcadores escolhidos. Idealmente, os marcadores deveriam ter uma heterozigotia de 100% e ser intra-génicos.

Neste trabalho proceder-se-á à amplificação por PCR do marcador D1S80. Este marcador está localizado em 1p36.3 e é um VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) com uma heterozigotia máxima de 80,8%. Os primers a utilizar têm a seguinte sequência:

5'- GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3'

5'- GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3'

Os produtos de amplificação deste marcador têm um tamanho que varia entre 430 e 750 bp. Os primers estão indicados na sequência seguinte a vermelho e a zona repetitiva do locus está indicada a azul (24 unidades de repetição neste exemplo).

  1 gaaactggcc tccaaacact gcccgccgtc cacggccggc cggtcctgcg tgtgaatgac

 61 tcaggagcgt attccccacg cgccagcact gcattcagat aagcgctggc tcagtgtcag

121 cccaaggaag acagaccaca ggcaaggagg accaccggaa aggaagacca ccggaaagga

181 agaccaccgg aaaggaagac cacaggcaag gaggaccacc ggaaaggaag accaccggca

241 aggaggacca ccggcaagga ggaccaccag gaaggaggac caccagcaag gaggaccacc

301 agcaaggagg accaccagga aggaggacca ccaggaagga ggaccaccgg caaggaggac

361 caccaggaag gaggaccacc aggaaggagg accaccggca aggaggacca ccaggaagga

421 gaaccaccag gaaggaggac caccaggaag gaggaccacc aggaaggagg accactggca

481 aggaagacca ccggcaagcc tgcaaggggc acgtgcatct ccaacaagac

O presente trabalho implica a elaboração de um relatório científico que deverá obedecer ao formato clássico deste tipo de textos: título e identificação dos autores; introdução (disponibilizando a informação mínima necessária para compreender a pergunta que vai ser feita); material e métodos (listagem de material e explicação sucinta da metodologia); resultados (descrição factual dos resultados, sempre que possível com recurso a imagens, esquemas e tabelas); discussão (interpretação dos resultados, estabelecimento de hipóteses explicativas e conclusões); bibliografia (usar o formato da bibliografia deste texto - última página).

Como sugestão para a discussão do relatório fornecem-se as seguintes palavras-chave: neuroblastoma; 1p36; LOH; D1S80; SRO (Shortest Region of Overlap); NB1; NB2; NB3; p73 (mutação, perda de expressão); sobrevida; terapia.

MATERIAL

Amostras

Protocolo

ATENÇÃO: A técnica de PCR é extremamente sensível a contaminações com DNA. Todo o material e reagentes tem que estar livres de DNA contaminante. De igual modo é necessário o máximo cuidado para evitar contaminações entre amostras; sempre que existam dúvidas quanto ao material (especialmente tubos e pontas de pipeta) é preferível substitui-los. Para controlar este problema todas as experiências têm que ser acompanhadas de um controlo negativo ou branco.

Embora a temperatura óptima de actividade da Taq polimerase seja 72⁰C, esta enzima começa a apresentar actividade a partir de @ 20⁰C. Para evitar a actividade precoce da enzima é necessário manter os componentes da reacção em gelo a @ 4⁰C antes de se iniciar a reacção de PCR.

As radiações UV provocam queimaduras. Cuidado a manusear o trans-iluminador de UV’s.

I- PCR

Cada grupo trabalhará ou com as amostras de DNA de sangue ou com as amostras de DNA tumoral. Durante a electroforese far-se-ão os emparelhamentos respectivos.

1- Num tubo eppendorf de 1,5 ml preparar a seguinte reacção:

            Água                           82,8 ml

            10x Tampão Taq       11,25 ml

            dNTP’s                       4,5 ml

            Primer F                     4,5 ml

            Primer R                     4,5 ml

            Taq polimerase         0,45 ml

         Os volumes correspondem a 4,5 vezes os volumes de uma reacção individual. Dado que o único componente que varia entre as diferentes amostras é o DNA, a preparação desta “Mix” poupa tempo e pipetagens.

2- Dividir esta mix por 4 tubos de PCR, medindo 24 ml para cada tubo.

3- A cada tubo de PCR adicionar 1 ml da amostra respectiva (Branco, A, B ou C).

4- Mantendo os tubos em gelo, programar o aparelho de PCR para o seguinte programa:

            - 94⁰C             4’

                                    - 94⁰C             30’’

         30 ciclos           - 70⁰C             30’’

                                    - 72⁰C             1’

            - 72⁰C             6’

            - 25⁰C             ¥

5- Rapidamente colocar os tubos no aparelho e iniciar a reacção.

II- Gel de agarose

1- Montar o suporte do gel e respectivos pentes.

2- Num matraz pesar 5 g de agarose e completar o volume até 200 ml com 1xTBE.

3- Ferver esta solução até à completa dissolução da agarose.

4- Baixar a temperatura até @ 50⁰C.

5- Adicionar 5 ml de Brometo de etídio ao gel e misturar bem.

6- Verter o gel no suporte respectivo e deixar solidificar durante 20 mins.

III- Electroforese

1- Com cuidado retirar o(s) pente(s) do gel.

2- A cada amostra adicionar 5 ml de 6x Azul de Bromofenol.

3- No 1º poço de cada linha do gel colocar 10 ml de marcador de peso molecular para DNA. Nos restantes poços colocar 25 ml das diferentes amostras.

4- Correr as amostras a 120 V até que o azul de bromofenol tenha migrado cerca de 2/3 do gel.

5- Visualizar o gel no trans-iluminador de UV’s e anotar os resultados obtidos.

Bibliografia

1- Ichimiya S, Nimura Y, Kageyama H, et al. p73 at chromosome 1p36.3 is lost in advanced stage neuroblastoma but its mutation is infrequent. Oncogene 18: 1061-1066, 1999.

2- Brodeur GM. Molecular basis for heterogeneity in human neuroblastomas. Eur J Cancer 31A: 505-510, 1995.

Resultados

Últimas modificações: 19-06-2003

Esta página foi visitada vezes desde 19-03-2000