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1ª Chamada - Ano lectivo 1999/20001- O vector pI
possuí dois locais de restrição, B e D. Descreva a estratégia mais simples
para introduzir os inserts 1, 2, 3 e 4 no vector pI. Tenha em consideração os
seguintes factos: o insert 2 deve ser mantido na orientação correcta; e a ligação
dos inserts 3 e 4 torna-se extremamente ineficiente se o local de restrição C
for transformado em “blunt end”. A, B e C –
“sticky end”; D – “blunt end”.
2- Cosmídeos e
YAC’s (Yeast artificial chromosomes) são dois dos mais usados vectores de
clonagem. Forneça uma breve descrição de cada um deles e compare-os quanto à
sua utilização em clonagem. 3- Um gene humano
foi clonado em Escherichia coli na tentativa de produzir a respectiva proteína.
No entanto, após crescimento das bactérias, não foi detectado qualquer
produto de expressão. a)- Discuta as
possíveis razões deste insucesso. b)- Indique e
explique um sistema alternativo para produzir esta proteína. 4- Descreva
uma estratégia que permita isolar clones genómicos e de cDNA da proteína
humana factor VIII (proteína de coagulação sanguínea produzida no fígado).
Como material de partida possui uma amostra de fígado humano e um clone de cDNA
do factor VIII de ratinho. Descreva todos os passos com detalhe.
E=EcoRI; B=BamHI
Num estudo são
utilizadas as estirpes “wild-type” e cinco estirpes mutantes. A análise é
feita da seguinte forma: i) Southern blot
– A DNA genómico de cada estirpe é digerido com EcoRI e é utilizada como
sonda radioactiva o fragmento de 4,1 kb. ii) Northern blot
- O RNA total de cada estirpe é isolado e é utilizada como sonda radioactiva o
fragmento de 4,1 kb. iii) Western blot
– São isoladas proteínas de cada uma das estirpes e é utilizado um
anticorpo anti-ptoteína A. Desenhe e
explique os três blots (i, ii e iii) resultantes das seguintes estirpes: a) Wild-type. b) Um mutante com
uma deleção na região 0,5-1,1 kb que inactiva totalmente o promotor. c) Um mutante com
uma mutação non-sense na posição 2,3 kb. d) Um mutante com
uma mutação missense na posição 2,6 kb que inactiva o local de restrição. e) Um mutante com
uma deleção na região 2,0-2,3 kb. f) Um mutante com uma deleção na região 3,0-3,6 kb. 6- O PCR
(Polymerase Chain Reaction) permite a amplificação exponencial do número de cópias
de uma determinada sequência alvo de DNA. Indique e discuta quatro parâmetros
que podem ser manipulados de forma a optimizar a reacção de PCR. 7- O projecto do
genoma Humano recorre a três grandes grupos de ferramentas: mapeamento genético,
mapeamento físico e sequenciação de DNA. Defina e discuta estas ferramentas
em termos de capacidade de resolução, exemplificando cada uma delas com uma técnica
à sua escolha. 8- Como
procederia para produzir e isolar uma proteína recombinante num mamífero?
Descreva os principais passos e o vector que utilizaria.
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