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2ª Chamada - Ano lectivo 1999/2000
1- O vector pI possuí três locais de restrição, B, C e E. Descreva a estratégia mais simples para introduzir os inserts 1, 2, 3 e 4 no vector pI. Tenha em consideração os seguintes factos: o insert 2 deve ser mantido na orientação correcta; na ligação do insert 3 o vector pI apresenta um alto índice de auto-ligação; o insert 4 torna-se extremamente ineficiente se o local de restrição D for transformado em "blunt end". A, B, C e D - "sticky end". E - "blunt end".
2- Cosmídeos e fagos l são dois dos mais usados vectores de clonagem. Forneça uma breve descrição de cada um deles e compare-os quanto à sua utilização em clonagem.
3- O método de complementação alfa permite a identificação de clones de bactérias recombinantes. Descreva, de forma sucinta, a estratégia subjacente a esta técnica e a necessidade de utilização de um sistema hospedeiro-vector específico.
4- Imagine que está a usar E. coli para produzir uma enzima e descobre que a estabilidade físico-química desta é má. Um colaborador sugere-lhe que a deleção dos aminoácidos das posições 12 a 20 irá melhorar a estabilidade desta. Descreva uma abordagem técnica que permita efectuar esta alteração na sequência recombinante.
5- Uma amostra de DNA genómico humano foi digerida com EcoRI. Após Southern blotting obteve-se o autoradiograma esquematizado na figura seguinte.
a) Justificando as suas respostas, explique qual seria o aspecto do autoradiograma se fosse efectuado o Southern blotting mas fosse excluído: i) A digestão enzimática com EcoRI. ii) A desnaturação pré-blotting. iii) A pré-hibridação da membrana. iv) A desnaturação da sonda. v) A lavagem da membrana.
b) As sondas são uma ferramenta fundamental da engenharia genética. Discuta a sua utilização no que se refere ao tipo de sonda e a factores capazes de influenciar a especificidade de hibridação.
c) Sumariamente, descreva um método de marcação de sondas.
6- Os estudos de linkage genético implicam a utilização de marcadores genéticos. Forneça uma breve descrição de três tipos de marcadores genéticos e compare-os quanto à sua resolução e informatividade.
7- O plasmídeo Ti ocorre naturalmente numa bactéria do solo, Agrobacterium tumefaciens, e é o único vector usado rotineiramente para produzir Plantas transgénicas. Devido às suas grandes dimensões a sua manipulação in vitro é problemática. No entanto, alterando geneticamente este vector e recorrendo a um vector intermediário é possível resolver este problema. De forma sucinta, explique esta estratégia de clonagem no plasmídeo Ti.
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