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Teste modelo de Engenharia Genética 1- Nomeie e descreva de forma sumária os três principais passos da extracção de DNA genómico de tecidos de mamíferos (não é necessário identificar reagentes químicos específicos).
2- As enzimas de restrição EcoRI e SmaI reconhecem as sequências descritas no quadro seguinte. a) Se fosse possível escolher qual delas utilizaria em clonagem? Justifique a resposta. b) Em que circunstâncias utilizaria a enzima preterida na alínea anterior?
3- Para um determinado gene foi possível isolar um clone de cDNA e outro de DNA genómico. A partir dos dados fornecidos nas figuras seguintes é possível determinar algumas características estruturais do gene e respectivo transcrito. a) O
fragmento de cDNA foi excisado do plasmídeo com EcoRI e marcado com 32P por
“end labelling”. Após digestão simultânea com HaeIII e TaqI obtiveram-se
os seguintes fragmentos:
Após digestão com TaqI obtiveram-se os seguintes fragmentos:
Determine o mapa de restrição do cDNA. b) O fragmento de DNA genómico foi excisado dum clone de fago l com EcoRI. Após marcação com 32P por “end labelling” e digestão completa com BamHI obtiveram-se os seguintes fragmentos:
Determine o mapa de restrição do DNA genómico c) Verificou-se que uma sonda de cDNA híbrida com os fragmentos de DNA genómico de 3,4 e 2,2 kb. O fragmento de 1,2 kb da TaqI híbrida com o fragmento de DNA genómico de 3,4 kb. Com qual fragmento de DNA genómico será de esperar que hibride o fragmento de 0,5 kb da TaqI e HaeIII? d) A que parte estrutural do gene corresponde o fragmento de DNA genómico de 3,0 kb? 4- Descreva, sumariamente, o método de marcação de DNA por “Nick translation”. Se preferir pode usar esquemas.
5- Compare (discutindo vantagens e desvantagens) o PCR (Polymerase chain reaction) e clonagem como métodos de amplificação de DNA.
6- O método de complementação alfa permite a identificação de clones de bactérias recombinantes em função da capacidade das bactérias de degradar, ou não, Xgal (substrato da b-galactosidase). Discuta a necessidade de utilização de um sistema hospedeiro-vector específico para esta metodologia.
7- Discuta o binómio restrição-metilação em clonagem.
8- Descreva um método de screening de clones recombinantes.
9- Descreva, de forma sucinta, e compare as técnicas de HA (Heteroduplex analysis) e SSCP (Single strand conformation polymorphism) para detecção de mutações.
10- Imagine que está a usar a E. coli para produzir uma enzima e descobre que a estabilidade térmica desta é má. Um colaborador sugere-lhe que a substituição do aminoácido isoleucina na posição 12 por uma cisteína irá melhorar a estabilidade térmica desta. Descreva uma abordagem técnica que permita efectuar esta alteração.
11- Descreva e discuta a importância da utilização de híbridos de células somáticas em mapeamento genético tendo em conta a resolução desta técnica.
12- Discuta os problemas potencialmente associados à produção de uma proteína humana num sistema hospedeiro-vector procariótico.
13- Descreva, de forma sumária, o estabelecimento de ratinhos KO.
14- Discuta a seguinte frase: “A engenharia genética iniciou-se com a descoberta das enzimas de restrição”.
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