一、題目：Hemoagglutination by viral antigen



二、原理及目的：

基本上，這是一種清學上用以偵測病毒抗原所引發的免疫反應所產生的抗體。包括有：

1. 沈澱反應：如白喉或炭疽毒毒素的偵測。
2. 凝集反應：病毒使血球發生凝集，如influenze virus、mumps virus、vvaccinia virus、myxovirus、poxvirus等，能夠與動物之紅血球，尤其是雞、天竺鼠及人類O型紅血球結合，形成團塊。
3. 中和性試驗：中和病毒的吸附感染。
4. 補體固定反應：血清的Ab和Ag作用秏掉補體。

在適當的條件下，這些Ag-Ab會形成網狀複合物。若抗原過剩，使得抗體的沈澱量淢少，血球下滑至漕孔底部形成小紅玷。當抗原抗體達到等量則開始有凝集沉澱反應，但是當抗體過量，又不足以發生沉澱反應，此時檢測上清液可以檢測到未結合的抗體。

三、材料及方法：

1.材料：

• 在allantoic fluid（尿囊液）中所培養出來的Influenza virus（流行性感冒病毒）。
• 0.8﹪的O型血之RBC懸浮液。
• 96洞的U型盤。
• Pipette （p-200/p-100）。
• Yellow tip.
• Phosphate-buffered saline（PBS，磷酸鹽緩衝液）

2.方法：

1. 病毒冰在-80℃的冰箱。
2. 第一行每洞加入50μl的PBS。
3. 第一行之第一個洞加入50μl的virus stock。
4. 以Pipette作兩倍稀釋（從A₁~A₁₂）。
5. 第一行各洞加入50μl的0.8﹪RBC懸浮液。
6. 室溫靜置至少1 hr.
7. 要做一個negative control（50μl PBS+50μl RBC懸浮液）。

四、結果：

有日本國旗者為不凝集、在A₆時開始凝集。由於1凝集單位為10⁶（或10⁷）個病毒，所以其原始的病毒濃度為2⁶×10⁶（個/l）。

五、討論：

實驗之前，先將病毒置於-80℃的尿囊液中。也可以放在-196℃的液態N₂。

在一開始，我們首先將病毒做一系列二倍稀釋，然後與定量之紅血球混合（在將50μl的0.8﹪RBC懸浮液加入時須在well拍一下以混合它），移至適當的溫度靜置1hr左右，立即觀察紅血球沉澱之形成。因為血凝現象在1小時後化解，因此必須在1小時內觀察。

當感冒從發生到2~3個星期之後，抗體不斷地提升。這時，我們為了確認病毒所做的實驗診斷便是凝血試驗。

我們將流行性感冒病毒從受感染的蛋或細胞培養中取出，將它放到雞、天竺鼠或人類紅血球。流行性感冒將會引起凝集反應並形成團塊。

這是因為Influenza viruses擁有兩種穩定的內在抗原：核蛋白（NP）和基質蛋白（MP）以及兩種可變的表面抗原：hemagglutinin（HA）和neuraminidase（NA）。藉由典型專一性的NP抗原和種族專一性的HA和NA表面抗原，Influenza viruses可以被鑑別出來。

至於其他如Myxovirus，則是因其紅血球凝集素成分為glycoprotein，發生凝集後可自然分離。Poxvirus的凝集成分為脂蛋白，亦可分離。但是像Togavirus凝集即是自己本身，就無法將其分離出來了。

本實驗是用U plate，它和V plate不同的地方在於V plate的敏感度較高但是有偽陽性。

假如我們利用一種接合試劑如氯化鉻使蛋白質附接到做為指示劑的紅血球上，即可令原來不能以血球凝集反應檢測出的抗原也可以凝集紅血球了！利用此種間接性被動血球凝集試驗法，可簡化鼻病毒感染病的血清學診斷，並可能迅速測定出B型病毒性肝炎的抗原（HBsAG）和抗體。

六、參考文獻：

Hemagglutination test‧微免實驗手冊（第39章）。

Jacquelyn G. Black (1993).Microbiology principles and Applications.(2版).Prentice hall, Inc.

王聖予、李麗俐等譯（民85）‧免疫學（4版）‧台北市：藝軒。

呂玉華（民76）‧微生物學‧台北市：合記。

李國鏞博士編著（民81）‧普通微生物學‧台北市：九州。

許秉寧編譯、蔡惠芳協譯（民78）‧醫用生物學上冊（17版）‧台北市：南山堂。