實驗名稱：Spirochetes

實驗原理：

Phase-contrast Microscopy是把位像差轉成亮度差，用以觀察活菌體的內部構造。

Dark field microscopy是利用繞射光，用以觀察透射光線難以觀察的菌體。

實驗目的：觀察螺旋菌的形態。

實驗材料：Phase-contrast Microscope 、Dark field microscope、Spirochetes。

實驗方法：

　　我們可以直接用Phase-contrast Microscopy來觀察，標本不需要等殊的準備或染色，即可產生對比之顯像作用。

　　除此之外，也可用Dark field microscopy法，藉由1000X的darkfield油鏡來觀察。要注意的是玻片的厚度是重要的，必須有1.0~1.1mm厚。

實驗結果：

　　Treponemes若出現在損傷物質中，是長的(5~20μm)、纖細的、緊密螺旋的Spirochetes，移動很慢(呈罕見的螺旋形移動)且可能在中央呈現彎曲。

　　對於這種難培養的微生物，用Phase-contrast Microscopy，即可清楚地看出它的形態。若用Dark field microscopy來觀察，也可以看出形態。

實驗討論：

　　Phase-contrast Microscopy是由荷蘭的一位科學家Fritz Zerniche所發明的，並在1935年獲得諾貝爾物理獎。主要的原理是利用改變通過標本的光線的位相關係，而產生對比之顯像作用。

　　用Dark field microscopy法觀察時，由於充滿著的活spirochetes可能有高的傳染性，所有的設備、病人樣本都要小心處理，立即拋棄受汙染的物質。看到的細菌在空泡、亮光處，為透明實像。若用特殊處理的顯微鏡看則是黑色較大的虛像。

　　另外，我們也可以用間接免疫螢光法來確認細菌，如Treponema pallidum。將專一性抗體溶液加在切片上，再加入標有螢光物質的專一性抗免疫球蛋白之抗體，然後在紫外線螢光顯微鏡下觀察。

　　Treponema pallidum被固定在玻片上並加入病人的血清。然後沖洗並加入標有螢光物質的專一性抗免疫球蛋白之抗體。假如有T. pallidum的病人血清和這種抗體反應，細菌將被染色(呈＋反應，見下圖)。假如沒有反應發生，螢光抗體將從抹片上被沖走，也就不會有螢光細菌被看到了(呈－反應)。

　　為了避免產生交叉反應，病人血清要先用Reiter treponeme的抽取物來吸附，我們稱這種方法為fluorescent treponemal antibody absorption(FTA-ABS)test，有很高的專一性。

　　其他血清學上的IF test有：

1. VDRL(Veneral Disease Research Lab)、RPR(Rapid Plasma Reagin) test：測量病人血清中cardiolipin antigen的凝集。
2. MHA.TP(Microhaemagglutination test for T. pallidum.)：針對T.pallidum 所做的微小紅血球凝集試驗。
3. TPCF(T. pallidium compliment fixation test)：檢出率高，但每天都要做一次。
4. TPI(T. pallidum immobilization test)：比較貴，主要是使螺旋菌失去運動性，而固定不動。

　　Microscopy適用於初期、第二期和生殖期，由skin lesions取分泌物，而不是從oral lesions。因為含有Spirochetes的正常口腔中通常有非致病性卻又像T. pallidum的細菌，導致誤診機率大。

　　其他的染色法有：

1. Gimesa stain：先用methanol細流，再用Gimesa solution。但是染起來不很理想。
2. Fontana stain：先用媒染劑細流，再用silver nitrate solution。
3. Negative Demonstration of Spirochetes--India ink method：背景為墨水的黑色，細菌處是空泡、透明狀。

　　由於Spirochetes不但厭氧且需要很高的營養，所以大部分是培養不出的。Treponema至目前為止不能用人工培養基培養。

　　至於螺旋體的抗藥性很弱，只有人和人之間的直接接觸才會有高傳染性，間接感染的情況則相當低。

　

參考文獻：

　　Ellen Jo Baron and Sydney M. Frinegold(1990).Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology(8th edition, pp446~447).The C.V. Mosby Company.

　　王聖予、李麗俐、陳慧琳等編譯(民85)‧IMMUNOLOGY免疫學(第4版，Roitt, Brostoff, Male原著，p28.5)‧台北市：藝軒。

　　Ronald M. Atlas(1995).Microorganisms in our World.(p494).Mosby.

　　Ellen Jo Baron and Sydney M. Frinegold(1990).Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology(8th edition, p446).The C.V. Mosby Company.

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