一、題目：ChickenEmbryo Inoculation

二、原理及目的：

因為病毒為細胞內寄生，所以欲分離檢體中的病毒，必須以活的細胞、組織或動物來接種培養。在目前，最常用的動物病毒培養方法有三種，其為雞蛋、組織培養的細胞以及活動物體內的培養。我們僅就雞胎胚試驗來做討論。

雞蛋是最早用於動物病毒培養的物體。一些不能在組織培養的細胞中生長的病毒，仍然利用此法繁殖。此外，作為疫苗的病毒，仍多以此法製備。此法的優點為方便、價廉及能培養多種的病毒。

我們可以用的接種法有：

1.卵黃囊接種（yolksac inoculation，YS inoculation）：卵黃囊是一個使卵黃流通的膜，而卵黃則是供給胚胎的營養物。

2.尿囊絨膜接種（chorioallantonicmembrane inoculation，CAM inoculation）：尿囊絨膜則是進行胚胎的氣體交換。

3.尿囊腔接種（allantonicinoculation，尿囊絨毛腔接種，chorioallantonicsac inoculation，CAS inoculation）：尿囊腔是一個液態充填的囊，進行胚胎代謝廢物的移除。

4.羊膜腔接種（amnioticinoculation，AMS inoculation）：羊膜腔則是一個融合腔，可以保護胚胎本身。

5.胚胎接種（embryoinoculation）：胚胎本身也可能是病毒接種的目標。

原理不外乎這些地方可以提供病毒所需的營養成分。其中，卵黃囊是最早發展出來的，可以支持許多病毒的生長。後來則又發展出羊膜腔和尿囊絨膜接種法來對適合需要更進一步發展細胞的病毒。

病毒的在胚胎中的分化，我們用肉眼有可能看得出來：通常包括胚胎的死亡，胚胎發展的受損和局部的膜損害，導致分離、不透明斑（pocks）。假如在雞胚胎的發展過程中不能顯示出明顯的症狀，病毒學家還有其他偵測的方法。胚胎溶液和組織可以被分離以利電子顯微鏡觀察。某些病毒還可用紅血球凝集法或者使用專一性抗體來針對符合的病毒。

等到確認是何種病毒，我們便可以用來作為治療的依據。這也是實驗的目的。

三、材料及方法：

1.材料：

• 10到12天的蛋
• 蛋的打孔器
• 燈光
• 1ml的無菌針筒液加上1.25吋的針（26/28標準口徑）
• Innoculum：avian influ virus（禽流感病毒H₆N₁型，為乾淨無臭味，和細菌汙染不同）。
• 75﹪alcohol
• Iodine tincture（碘酒）
• Cotton（棉花）
• Wax（封蠟）

2.方法：

1. 看蛋是死是活，照光，照出氣室並畫出。
2. 用75﹪的酒精棉擦拭蛋表面，再用碘酒棉塗接種區以消毒。
3. 用乾淨的大頭針瞬間在氣室旁2mm處插入一個洞。
4. 每一個蛋打入0.1ml的病毒。
5. 用指甲油（或封蠟）把蛋封住（多封幾層）。
6. 寫組別放入35℃下培養。
7. Candle the egg 24 hr PI.
8. Candling the egg twice a day.
9. Store the dead egg at 4℃ overnight.
10. 拿出尿囊液（allantoic fluid）並檢查壞死的情形。

四、結果：

若有病毒感染將會黑黑的（凝集現象），出血、畸型或水腫。下面顯示兩種不同的情形：本實驗是接種於尿囊。

1.normal：接種失敗（未插到尿囊）的第19天雞胚，長成有毛的幼雞，沒有出血的現象。

2.abnormal：接種12天的雞胚因感染avianinflu virus而全身出血無毛。

五、討論：

胚胎是動物的最早發展階段，許多細胞正在快速分化中。鳥類的胚胎期是躲在封閉的保護性的蛋中，這使得利用病毒感染胚胎蛋變成是一種十分可行的方法。在蛋中，它會自行供給營養，而且是一個無菌的環境，提供了數種可以支持細胞生長的胚胎組織。

我們最常用來培養的胚胎除了雞外，還有鴨、火雞等。當然，在實驗的過程中都要非常地小心：首先要用燈照射，來看氣室的存在，蛋殼有無裂痕，有血管即是活蛋。選了好蛋之後就可以開始接種了！

各種不同的部位適用於不同的病毒接種：

1.卵黃囊接種（YSinoculation）：使用7~12天的雞胚胎。適合𣿅疹病毒，會造成胚胎死亡。

2.尿囊絨膜接種（CAMinoculation）：使用7~12天的雞胚胎。例如：黏液瘤病毒（myxomairus）在尿囊絨膜上生長最佳。此種接種適合𣿅疹病毒、痘病毒及某些套膜病毒，會形成痘斑，如下圖所示：

3.尿囊腔接種（CASinoculation）：使用7~12天的雞胚胎。流行性感冒病毒適合在此培養，會造成血球凝集。而流行性腮腺炎病毒（mumpsvirus）於尿囊腔中繁殖最速。

4.羊膜腔接種（AMSinoculation）：使用9~12天的雞胚胎。流行性感冒病毒和腮腺炎病毒適合培養，亦會造成血球凝集。

再復習一下胚胎的部分功用：YS是靠著穿透膜和血管來將囊內營養物送到胚胎。CAM和CAS則是用於移除可溶、不可溶和氣態的代謝產物。AMS則是非常薄的膜，尤其是在4~9天的時候。這個膜及其內容物（如人胚胎時期之羊水）可以保護胚胎去對抗物理性的損害和轉換區的功能。

下圖是顯示胚胎蛋的病毒接種，總有5種接種方式：

病毒的感染和細菌不同，細菌是濃濁且臭，病毒則是流出液清澈，而且通常在感染24hr後，雞胚開始慢慢死亡。此外也有可能在膜上產生痘泡（pock），其為膜上生長有病毒之處，特徵為厚度較大，失去原有的顏色，圓形小點。利用此等外在的徵兆，我們可以大略地判斷病毒生長的情形。蛋內的流液也可以作為測數之用。

已知分離檢體中的病毒主要是雞胚胎培養、動物接種、組織培養（含primaryculture、secondary culture、celllines culture）三種。在做雞胚胎培養之後，若要更確定其抗原，可用螢光免疫法或ELISA或放射免疫分析法來做確認。

本次用的是禽流感病毒H₆N₁型，已知其HA有15種，NA有9種。最近在香港流行的禽流感病毒則為H₅N₁型。

這種使用雞胚胎培養的病毒，有的也可以做成疫苗。不過有一點要特別注意的是，當我們接受疫苗的時候要考慮是否會對雞蛋過敏，因為在整個過程中，蛋白可能已經存在於病毒疫苗了！

六、參考文獻：

Jacquelyn G. Black(1993).Microbiology principles and Applications.(2版).Prenticehall, Inc.

Kathleen Talaro,Arthur Talaro.(1993).Foundations in Microbiology. Wm. C.Brown Publishers.

呂玉華（民76）‧微生物學‧台北市：合記。

李國鏞博士編著（民81）‧普通微生物學‧台北市：九州。

許秉寧編譯、蔡惠芳協譯（民78）‧醫用生物學上冊（17版）‧台北市：南山堂。