STEROIDI -
ZUCCHERI - LIPIDI - AMMINOACIDI
Amminoacidi
Si può affermare che un po'
tutti i metodi cromatografici sono stati impiegati per lo studio degli
amminoacidi; negli ultimi anni sono state descritte numerose tecniche di
separazione su strato sottile con gli adsorbenti più vari: gel di silice,
cellulosa, celite, amido e gel di silice mescolato a terra silicea. Tuttavia la
cromatografia su carta
e quella su colonna a scambio ionico sembrano essere ancora i metodi elettivi
per l’analisi degli amminoacidi contenuti nei liquidi biologici.
La cromatografia su carta è il metodo più usato nella pratica clinica per la
determinazione degli amminoacidi. Si tratta di un metodo semplice ed economico
ed è anche possibile la contemporanea analisi di più campioni. Va
sottolineato, tuttavia, che l'interpretazione dei dati va fatta con cautela
poichè questa metodica è essenzialmente qualitativa. Essa può essere
considerata al massimo semiquantitativa quando il campione da analizzare sia
stato precedentemente desalificato. Nonostante questa limitazione, la
cromatografia su carta degli amminoacidi sierici e urinari è giustamente
considerata uno dei metodi più utili nella diagnostica di laboratorio. Con
mezzi complessi come le urine e il sangue è indispensabile eseguire una
cromatografia bidimensionale.
La cromatografia su colonna a scambio ionico
permette la contemporanea determinazione quantitativa di vari amminoacidi
contenuti in un determinato campione, anche se presenti in piccola quantità.
Allo stato attuale è questa la metodica più indicata per lo studio delle
malattie metaboliche congenite o acquisite che si accompagnano alla
modificazione della composizione degli amminoacidi ematici e urinari, e non è
necessaria la preliminare desalificazione del campione.
Gli inconvenienti sono costituiti dal costo elevato delle apparecchiature, dai
tempi di esecuzione spesso lunghi e dalle necessità di personale qualificato,
anche se la recente introduzione di apparecchi automatizzati ha notevolmente
ridotto gli inconvenienti suddetti.
Zuccheri
L’identificazione e la
determinazione di mono- e di-saccaridi nei liquidi biologici e di estrema utilità
nella diagnosi di alcune malattie ereditarie dovute alla deficienza di uno degli
enzimi preposti al metabolismo degli zuccheri.
L’individuazione di molti quadri morbosi dovuti ai difetti suddetti è stata
resa possibile proprio grazie all’applicazione clinica delle metodiche
cromatografiche. Il metodo più comunemente impiegato è la cromatografia su
carta; tuttavia da alcuni anni si preferisce la cromatografia su strato sottile.
A scopo diagnostico è spesso sufficiente la sola ricerca qualitativa. Il
campione biologico prima della cromatografia deve essere desalificato, perchè
la presenza di sali può alterare la migrazione sulla carta e interferire con lo
sviluppo della colorazione dopo l’applicazione del reattivo, specie quando
vengono usati sistemi solventi basici.
Per l’identificazione di alcuni zuccheri può essere necessario l’impiego di
diversi sistemi solventi o, nel caso della cromatografia su strato sottile, di
differenti supporti.
Lipidi
La cromatografia su strato
sottile e la gascromatografia
sono le metodiche di gran lunga più usate nello studio dei lipidi.
Un’accurata analisi quantitativa e qualitativa di questi, anche se presenti in
piccole quantità nei campioni biologici (sangue, latte, etc.), é resa
possibile dall’impiego associato delle due tecniche cromatografiche. Il
sistema di scelta per lo studio completo dell’estratto lipidico è costituito
da una prima separazione (su strato sottile di gel
di silice) nelle singole classi lipidiche.
Le zone corrispondenti al punto di migrazione delle frazioni vengono eluite,
metilate e sottoposte ad analisi gascromatografica. Grazie ad essa si può
risalire alla determinazione quantitativa degli acidi grassi contenuti nella
frazione in esame.
La corretta esecuzione di questo metodo permette determinazioni accurate per cui
questo viene considerato il metodo elettivo soprattutto per la determinazione
dei trigliceridi. Senza ulteriori analisi è possibile, inoltre, ottenere
informazioni sulla concentrazione dei singoli acidi grassi.
Ormoni
steroidei
Lo studio del metabolismo degli
ormoni steroidei ha subito un notevolissimo impulso con l’introduzione nella
pratica di laboratorio della cromatografia su strato sottile e della
gascromatografia.
L’impiego della cromatografia per lo studio degli steroidi estratti dalle
urine viene praticato dopo idrolisi degli ormoni solfo- o glucurono-coniugati
per purificare preliminarmente l’estratto e per frazionarlo in gruppi di
composti simili. Per questo scopo viene preferita la cromatografia su strato
sottile.
Per migliorare le prestazioni della
gascromatografia si usano rivelatori a ionizzazione di argon, che sono stati
usati più frequentemente negli anni trascorsi, e quelli a ionizzazione di
fiamma che sembra stiano attualmente guadagnando in affidabilità. I rilevatori
a cattura di elettroni hanno dato risultati inferiori ai due precedenti.
La determinazione degli steroidi circolanti nel sangue è stata perfezionata
negli ultimi anni con la "doppia diluizione isotopica" che permette di
ottenere risultati precisi anche per quantità di sostanze inferiori al
nanogrammo.
La purificazione degli ormoni estratti è, spesso, ottenuta con l’impiego
della cromatografia su carta.
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